[原创]（持续更新和回复）如何用石蜡切片做出高质量免疫组化和免疫荧光图之经验
组织病理染色是我们做研究经常需要用到的实验技术，是基本的实验室技术之一。很多人都认为病理染色相对Western blot（见本人另一篇经验贴【原创】资深WB科研狗吐血整理“玄学”之汇总版经验技巧（会回复问题））来说更容易出结果，这一点我不否认，但要想做出一张漂亮的图还是有点难度的，尤其是免疫荧光。本人在这方面算得上是有点经验，做出来的图片受到导师和同学们的一致认可。今天就跟大家分享一下我艰辛摸索出来的经验。
本文将从取材部分开始讲，到显微镜拍片结束。由于本人基本只做中枢神经系统的研究，所以下面以鼠脑为例。
一、 取材
1、物品试剂准备：生理盐水或PBS（每只小鼠80ml），4%多聚甲或者10%中性福尔马林（每只小鼠100ml），麻药，250ml玻璃烧杯两个，泡沫箱两个，泡沫箱盖子一个，1ml注射器一个，20ml注射器两个，7号头皮针一个，大头针四个，止血弯钳（12.5cm）两把，组织剪一把（25cm），眼科剪一把，眼科弯镊一把，10mlEP管若干（一个鼠脑一管，提前装好固定液）。
需要注意的是，如果要自己配4%（质量体积分数）多聚甲醛固定液，则需要购买多聚甲醛固体。配置方法有些注意事项，以配2 L 工作液为例。方法一是加热溶解法，称取80 g 多聚甲醛固体，加入1900 ml PBS工作液中，推荐使用2L 的锥形烧瓶做容器，然后瓶口套上橡胶手套，以减少多聚甲醛挥发，将烧瓶置于烤箱中65 ℃ 烤10 h 左右，可见大部分固体已经溶解，然后转移至磁搅拌器上搅拌15 min，可见溶液几乎完全澄清。溶解后自然冷却，取下手套，加PBS工作液定容至2000 ml，转移至密闭容器中保存，使用前预冷。方法二是加碱溶解法，加0.1 g氢氧化钠固体，无需加热，室温搅拌至固体完全溶解，定容后滴加盐酸将pH调至7.5左右，其他操作类似方法一。
2、取材步骤
心脏灌注 首先是麻醉小鼠。等待麻醉诱导时把两个烧杯分别装上生理盐水和多聚甲，然后将烧杯半埋在冰中预冷。麻醉后用大头针将小鼠固定于泡沫箱盖子上（用组织剪戳个洞，用以引流灌注出来的废液至泡沫箱中），暴露小鼠胸腔和心脏（用止血钳固定，用组织剪剪皮和开胸），注意别剪破肝脏和肺脏了，暴露后持止血弯钳稍微用力夹住一点心尖部（不要锁死钳子,留出进针的缝隙），微微用力向上提，仔细看心尖两侧颜色深浅，较浅那边是左心室部分，然后用头皮针（剪断针尖斜面，以防戳穿心底，提前接上装满生理盐水的注射器并赶走导管中的气泡）从心尖沿着左心室的长轴进针，全神贯注体会手感，当刚好有突破感时再进一点点，这时锁死止血钳。然后用眼科镊夹起右心耳，并以眼科剪剪破之，见暗红的血涌出，接着手推注射器活塞，大概半分钟推完20ml生理盐水，连推4管，这期间观察肝脏颜色、肺脏大小及口鼻有无渗液。灌注成功的判断有以下几点：肝脏在推完40ml生理盐水前逐渐变成桃黄色，肺脏无明显肿大，口鼻无明显渗液。最重要的是看肝脏颜色变化，有时肺脏肿大，口鼻有明显渗液也不一定提示失败。然后是推多聚甲，80ml，注意观察小鼠的四肢及尾巴有无颤动痉挛，一般灌注得好的话会有明显的上述反应，这是多聚甲刺激神经肌肉的结果。灌完多聚甲后，小鼠身体应该硬成板状。（灌注这一步很关键，直接关系到染色效果，尤其是做免疫荧光，红细胞有自发荧光效应，在488和555激发光下都可以看到明亮的荧光，也是很难的一个环节，希望大家重视。）
取脑 用组织剪从耳后剪下头颅，再在头顶正中剪一刀头皮，把其往两侧剥，这时可以透过菲薄的颅骨看到白色的大脑，修剪枕骨大孔附近的颈部肌肉，改用眼科剪，在枕骨大孔3点和9点钟的位置各剪一刀，然后一手固定头颅，另一手用止血弯钳从枕骨大孔处开始依次撬开枕骨，顶骨，额骨，注意钳子尖端不要向着脑组织，以免损坏皮层，还有留意硬脑膜可能扯裂脑组织，暴露至嗅球时用眼科弯镊从嗅球前下方勾起整个脑组织，离断颅底的脑神经，将脑组织转移至装有多聚甲的EP管中。（这一步各取所需，不是研究脑的可以忽略。）
需要灌注取材的视频可以私聊获取，由于文件过大，又比较血腥，不宜直接放到文章里。
二、 后固定
取材后将泡在多聚甲的标本置于4度冰箱中，24小时后赶紧进入下一环节：脱水、透明、浸蜡、包埋。这里也要注意，由于取材时进行了多聚甲灌注，所以后固定尽量不要超过24小时，至多一周，固定时间越长，抗原表位被封闭得越牢，后期染色阳性信号越低，尤其是免疫荧光受其影响很大。
三、 石蜡切片之脱水、透明、浸蜡、包埋
脱水：先从多聚甲中取出标本，自来水冲一遍，将脑置于脑模具中切块，一般建议每块厚度在2-3毫米（这里也要提醒一下，不要切太厚，否则脱水浸蜡不充分后期染色容易图片碎片），然后装进包埋盒中，用铅笔标记包埋盒，盖好盖子，置于流水中冲洗2小时，然后转移至浓度梯度酒精中，依次是50% 90min；75% 90min；85% 120min 95% 120min；100%I 90min；100%II 60min。（这里浓度梯度和时间可以根据自己经验加以调整。）
透明：一次是无水乙醇二甲苯（1：1）60min；二甲苯I 30min；二甲苯II 30min；二甲苯III 30min。
浸蜡：（65度）石蜡I 60min；石蜡II 60min；石蜡III 30min；石蜡IV 30min。
以上三步一般在自动脱水机中完成。
包埋：选择合适大小的蜡托进行包埋，底面积最好要是标本截面面积的5倍以上，注意不要有气泡。包埋后蜡块常温保存即可，一般存三五年都影响不大，有人说可以存几十年。
四、冰冻切片之脱水、包埋
脱水：冰冻切片的样本用梯度蔗糖溶液（PBS为溶剂）脱水，组织先浸泡于15%蔗糖溶液(质量体积分数)静置过夜，待组织沉底后换30%蔗糖溶液，再次过夜沉底后可进行OCT包埋。
包埋：建议在冰冻切片机的冷台包埋，这样一是可以避免液氮速冻容易造成组织碎裂，二是可以避免-80℃慢冻形成冰晶。OCT包埋后用锡纸包裹组织，提前在锡纸外表面做好标记，然后转移至-80℃冰箱中保存。
五、 切片
石蜡切片要比冰冻切片简单一些。有3个注意事项，一是切之前先预冷，可以开启包埋机的冷台，零下4度，提前20min冻，然后切的过程中蜡块升温变软容易皱，这是可以再放回冷台冻一阵再切。二是刀片要用新的，如果看到切出来的切片有明显划痕赶紧换个新的位置切。如果没有冷台就放-20度冰箱预冷，切的过程也可放在冰上复冷。三是最重要的一点，片子晾干后如何保存，如果一月之内做染色的常温保存即可，如果考虑要存放超过一个月的，可以放4度冰箱，还可以装在抽真空袋中再放冰箱。建议要染色时再切，因为片子切了之后就暴露在空气中了，会氧化，后果是信号减弱，背景加深，尤其是做免疫荧光。
左:白片放置了一年，斑片分布的絮状绿色是非特异性荧光。 右:白片放置了一周，明显没有絮状绿色非特异性信号。
冰冻切片一般选择20-40微米的厚度。冰冻切片有两种常规方法，一是漂片，漂片是组织切片直接浸泡于防冻液中保存，染完色才贴片拍照；二是贴片，贴片是切片先贴于载玻片上（注意防皱），-80℃保存，染色操作在载玻片上完成。
六、 石蜡切片之染色（从烤片到封片）
烤片：将片子放置于染色架上（一般用不锈钢的，做跟铁染色相关的可以用塑料的），65度烤1-2小时。
脱蜡：迅速从烤箱中转移至二甲苯中，二甲苯I 10min；二甲苯II 10min；二甲苯III 10min。
水化：高浓度到低浓度酒精，100% 5min；95% 5min；85% 5min 75% 5min。（冰冻切片无需烤片脱蜡水化）
从这一步开始HE，组化和免疫荧光染色就各不相同了。
1、 HE：苏木素伊红染色（冰冻切片不推荐用于HE染色）
水化后流水冲洗5min，苏木素染色10min，流水冲洗10min，1%盐酸酒精分化2s，流水冲1min，伊红染色30s。
脱水：75%酒精30s，85%酒精1min，95%酒精5min，100%酒精5min。
透明：二甲苯I 10min，二甲苯II 10min，二甲苯III 10min。
封片：中性树胶封片，用棉签棒蘸，这里有两个小技巧，一要在二甲苯未完全挥发之前加树胶，借助二甲苯的溶解增加树胶的流动性，这样能减少气泡；二要控制树胶的量，每张切片一小滴就够了。封完片留在通风橱中1小时后再取出，因为二甲苯没挥发完，直接拿出通风橱会污染室内空气。
2、 组化染色（SP三步法DAB显色）
漂洗：水化后纯水摇洗，3min X 3次；
抗原修复：微波炉，柠檬酸钠抗原修复液（pH6.8），先预热，然后将片子置入修复液中，高火煮至沸腾，转中火维持10min；接着自然冷却至室温（注意不要将片子从修复液中提起，不能让组织切片骤冷）；注意了，此步之后透明封片之前不能干片，否则会有明显的边缘效应，就是干过的地方有稍微深染的黄色背景。
PBS摇洗，3min X 3次；组化笔圈起组织；（冰冻切片较厚，这里建议用0.3% Triton X-100（溶剂为PBS）透化膜15min，然后PBS摇洗）
封闭内源性过氧化物酶活性：常温孵育3%过氧化氢溶液15min；
PBS摇洗，3min X 3次；
血清封闭：10%二抗同源血清（PBS稀释）常温封闭30min；
孵一抗：滴加一抗（10%二抗同源血清稀释），注意覆盖全组织即可，湿盒（放少量水）中4度孵育12-18小时；
复温30min：从冰箱将湿盒拿出室温环境中静置30min。
PBS摇洗，5min X 3次；
孵二抗：滴加生物素标记的二抗（10%二抗同源血清稀释），常温孵育15min。
PBS摇洗，5min X 3次；
孵HRP：滴辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（PBS稀释），常温孵育15min。
PBS摇洗，5min X 3次；
DAB显色：DAB工作液现配现用，每张切片覆盖全即可，镜下观察，秒表计时反应时间，同一个指标尽量控制相同的反应时间。注意不要20倍及以上的高倍镜观察，否则显色液会污染镜头。
显色结束用自来水终止反应，流水冲洗5min；
苏木素染色3min，流水冲洗10min；
1%盐酸酒精分化2s，流水冲1min；
脱水、透明、封片操作同HE染色相应部分。
3、 免疫荧光染色
水化后纯水摇洗，3min X 3次；
石蜡切片之抗原修复：微波炉，EDTA抗原修复液（pH8.0）或者Tis-EDTA抗原修复液（pH9.0），这里的修复液跟组化用的不一样，因为组化的是三步法，多了一级放大，所以组化的灵敏度高许多，但是荧光只有两步，灵敏度低，所以要从抗原修复的途径增大最后的信号，一般来说pH越高，不要超过9.5，抗原表位修复得越充分，但也要注意脱片的问题。举个例子，我之前有的指标，用其他修复液加长修复时间和升高修复温度都比不上Tis-EDTA抗原修复液的效果，操作同组化相应步骤。
TBS摇洗，3min X 3次；组化笔圈起组织；
封闭：10%二抗同源血清常温封闭60min；
孵一抗复温同组化相应部分；
TBST（TBS中加0.1%吐温20）摇洗第一遍5min ，然后TBS摇洗3min X 2次；
孵二抗：荧光二抗之后的步骤开始避光操作，滴加二抗（10%二抗同源血清稀释），常温孵育60min。
TBST摇洗第一遍5min ，然后TBS摇洗3min X 2次；
孵Dapi：滴加Dapi水溶液，常温孵育10min；
TBST摇洗第一遍5min ，然后TBS摇洗3min X 2次；
封片：抗荧光淬灭剂封片剂，用棉签棒蘸取少量封片剂，滴于组织边上，这里有一个重点:消除气泡的技巧，一手固定载玻片，另一手将盖玻片一侧先靠在载玻片侧缘，再缓缓放下盖玻片的另一侧，仔细观察，待盖玻片接触到封片剂后才松手，否则气泡将几乎不可避免，本方法是本人摸索了很久才发现的，在我发现之前，整个实验室还没有人找到很好地消除气泡的办法。然后用指甲油加固，涂在盖玻片四周。具体操作方法如下视频所示：
七、冰冻切片之染色（无需烤片和脱蜡）
1、组化染色（SP三步法DAB显色）
漂洗：从-80 ℃ 取出片子晾干，PBS摇洗，3min X 3次。
后续操作从抗原修复到封片，操作基本与石蜡切片的相应步骤一致，唯一的不同是在抗原修复后增加透膜这一步（见冰冻切片免疫荧光染色部分）。
2、免疫荧光染色
漂洗：从-80 ℃ 取出片子晾干，PBS摇洗，3min X 3次。
抗原修复：由于冰冻切片在EDTA抗原修复液中热修复极容易脱片，所以推荐使用柠檬酸-EDTA混合抗原修复液（具体配方私聊）。这样既能充分修复抗原又能保证不脱片。修复冷却后，TBS摇洗，3min X 3次；组化笔圈起组织；
透膜：0.3%PBST（Triton X-100）常温孵育15min；
TBS摇洗，3min X 3次；
后续操作从血清封闭到封片同石蜡切片免疫荧光染色相应步骤。
八、 拍照
拍照前准备：拍照前先检查片子上有多余的树胶，封片剂，灰尘等影响观察或污染镜头的因素，如果树胶干了很难清洁怎么办，可以用无水乙醇棉球擦拭，注意不要来回擦，要同一个方向擦，棉球擦过接触面就不能再擦了，因为接触面溶解了树胶，回擦又弄脏了擦过的地方，清洁干净后方可镜下拍照。
明场拍照：注意先拍低倍再拍高倍，命名要对应，匹配好光圈，可以选自动曝光，自动白平衡，一般同一批片子尽量用相同的参数拍。
荧光拍照：避光拍照，除了明场拍照的要求外，更要注意的是在激发光的照射下荧光信号会很快衰减，所以要干脆利落。这里要强调的是同一个指标拍照参数要基本一致，包括激发光光强，曝光时间，增益大小，亮度对比度。还有两个困扰很多实验者问题，一是Dapi与FITC通道串色(在FITC通道可以看到本来在Dapi出现的形态)，这是因为这两者的激发光波长相邻，发射光波长相近，在Dapi通道下强曝光之后就会发生明显的串色，我发现有一个办法能很好地解决这个问题：就是用很低光强去激发Dapi（5%以下功率），大幅调小Dapi曝光时间，10倍镜用50ms左右，20倍镜用5ms左右，40倍镜用30ms左右，然后先拍其他通道的最后拍Dapi，这样基本就不串色了。最后核拍出来可能不太清晰，拍完后处理，增加亮度，因为核不需要特别好看，能说明目的蛋白的定位即可。二是Txred（555nm）与Cy5(647nm)串色，原理跟上述问题相同，但是因为这两者都是目的，不好调，所以一般不建议染三个靶标，实在要染，可以试一下不染核，用Dapi通道波段的荧光二抗，488,555或者647来三标。
以上是今天的全部内容，祝各位实验顺利，早出成果，更多细节问题，可以在讨论区留言，但在讨论区回复可能不及时，若需及时回复，可以私聊，如果觉得有用，希望能留下你美好的点赞，也欢迎推荐给你身边的人，更欢迎转发朋友圈。
另外，本人还发布了其他有关科研的经验帖或疾病知识的科普知识，需要的请点击以下链接自取。
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最后编辑于 2023-10-09 · 浏览 4.3 万
