怎样做好免疫组化呢？这些经验要知道

一提到免疫组化（IHC)实验，繁琐的操作步骤总是另人头疼。实际IHC 实验并不难，由于操作步骤较多，因此造成影响实验结果的因素较多，可谓是稍有疏忽就全盘皆输，但也不是没有解决办法，我把免疫组化操作中常见问题和解决方法汇总给大家，需要做的到我个人主页找我

1、切片染色深

问题原因：一抗浓度过高是造成切片染色深常见的原因之一。

解决方法：是在每次使用新抗体前对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，包括即用型的抗体也同样需要进行测试，不能只简单的按照说明书进行染色。

2、时间过长或温度过高影响实验结果

问题原因：忽视操作规程，没有严格控制时间，因遗忘而造成时间延长或温度过高。

解决方法：实验人员应当严格执行操作规程，随身佩带报时表或报时钟，及时提醒。现在流行的二步法敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的 1 小时，而是 30 分钟，因此，要根据染色结果进行调整。

3、DAB显色不理想

问题原因：DAB 变质或显色时间太长。

解决方法：DAB 最好现用现配，如有沉渣，应进行过滤后再使用。当染色片太多或使用染色机，导致无法及时进行终止操作时，也应该尽量对新的，或使用频率不高的抗体，进行显色时的监控，避免显色时间过长。

配制好的 DAB 不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与 DAB 产生反应，从而降低 DAB 的效力；像未用完的 DAB 存放在冰箱里，需要的时候再取用的这种行为也是不可取的。DAB 的显色最好在显微镜下监控，待达到理想的染色程度时，应立即终止反应。

4、操作过程中脱片

（1）可能是黏附载玻片质量的问题，建议尝试更换载玻片。

（2）组织切的不好，可能是切片机刀片较钝造成切片切的厚、不均匀，或者是切片机操作者手法不熟练等。

（3）可能是组织的问题，比如癌症组织有坏死情况时，也容易造成脱片。

（4）烘烤结果不理想，可能是烘烤时间较短或温度不够等。

（5）操作时甩动幅度过猛，有脱片嫌疑的切片最好不甩或轻轻甩，可用卫生纸从边缘上慢慢吸水。

（6）修复过程出现问题，比如在抗原修复时，高压时间过长，或者放进 100 度修复液时不够平稳，也容易出现脱片的情况。此外，用 EDTA 修复比柠檬酸更容易脱片。

（7）一旦见到有组织漂起来，在操作时就要更加谨慎，使用 PBS 的时候尽量泡，不要冲。