【原创】资深WB科研狗吐血整理“玄学”之汇总版经验技巧（会回复问题）
yj1984ren 推荐不像组织切片HE染色，免疫组化和免疫荧光那样可重复（见本人另一个经验帖[原创]（持续更新和回复）如何用石蜡切片做出高质量免疫组化和免疫荧光图之经验），Western blot常常被我们叫做“玄学”，因为这门技术让人琢磨不透，很难做到结果可重复，明明上了相同体积的同个样品，可常常出现复孔的条带趋势不一致。然而，经过我一年半的用心琢磨，我有八成的把握做到了WB结果可重复，所以我们实验室（医院公共实验室）的同学遇到WB方面的问题一般都会来找我求助，当然一般我也能给出有用的建议。今天我就想各位同行分享一下我的经验，希望能帮到有需要的人，如果已经是“WB大神”的也请看看，欢迎指正！
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我们知道WB实验步骤繁琐，一次实验历时也不短，从提蛋白到显影结束可能要三天，我们就讲一下这里面的一些关键环节，若想探讨更多细节，欢迎在讨论区留言交流，我尽量及时回复。主要讨论三部分内容：分别是实验步骤，制胶技巧和WB常见问题分析。
1、 实验步骤
1.1 蛋白提取及变性
1.1.1提取蛋白
首先要强调的是，蛋白提取是影响WB结果最重要的环节。该过程最重要的是防止降解和保证较高的蛋白浓度。防止降解主要有两点，一是裂解前注意保持样品处于低温环境中，二是裂解时加入足够的蛋白酶抑制剂。我们习惯先用冰冷的PBS做心脏的体循环灌注（步骤见另一组织切片经验帖），然后冰上取脑，分离各脑区（嗅球，皮层，海马，中脑，小脑，延髓，丘脑，纹状体）后置于1.5EP管中，用液氮速冻后转移至-80度冰箱长期保存。接着是保证蛋白浓度，即要加入适量的裂解液，太少会使蛋白提取不充分，太多则蛋白浓度太低，一般经验是这样的，细胞样品例如一个六孔板的细胞加60微升的裂解液，动物组织的话每毫克组织加20微升裂解液。研磨完后最好再冰上超声（超声破碎仪）进一步处理，30%的输出功率，超声5秒，停5秒，连续10个循环。注意事项是，用1.5mL EP管装蛋白液，至少200微升总体积，最多1000微升，太少容易产气泡，太多会溢出，工作时保证超声探头保持在液面以下4mm甚至更下（防止产气泡）。超声对提取膜蛋白和核蛋白尤其有效，其实对胞质蛋白也有好处。超声不仅可以破碎细胞和细胞器，而且能促进蛋白质和脂质、核酸分离开，得到的蛋白溶液更纯。如果没有超声破碎仪，可用1毫升注射器替代，冰上反复抽吸1分钟左右，注意不要产生过多气泡。（需要灌注取材的视频可以私聊获取，由于文件过大，又比较血腥，不宜直接放到文章里。）
1.1.2蛋白变性
加上样缓冲液后100摄氏度煮10分钟，蛋白上样缓冲液有两种还原剂（打开二硫键维持一级结构）可选，一种是beta巯基乙醇，气味很大，毒性大，另一种是DTT（二硫苏糖醇），气味较小，毒性较小。两者的作用是一样的，但特点不一样，前者更容易与氧气反应，稳定性比后者差，如果在常温下暴露在空中，前者只能维持24小时的活性，后者却可以维持7天左右。所以该如何选择？如果是蛋白样品较少，跑几次就可以用完的样品，这时选择beta巯基乙醇。如果样品很多，计划跑上几十次的，优先选择DTT。不管用什么还原剂，都建议变性后分装-80度保存。
1.2 SDS-PAGE凝胶配制
1.2.1配胶前准备
首先强调一下，一块好的胶是跑好蛋白的前提，所以这个环节也不容忽视。玻璃板的选择，一种是1毫米厚度的，另一种是1.5毫米的，这个厚度选择也是有讲究的，如果上样体积小于10微升，优先选1毫米，否则选1.5毫米的。原因是什么？答案在转膜部分揭晓。还有分离胶的浓度也要选择适合的。然后玻璃板和梳子要洗干净，晾干。装板，注意厚板和薄板的底部要对齐，否则会漏胶。加制胶的各成分前，要观察液体是否有沉淀，有沉淀的尽量不要用。
1.2.2制胶
按配方说明依次加入分离胶的各组分，加完SDS后先简单手动摇匀几下，然后迅速加入过硫酸铵和TEMED, 摇匀，紧接着就灌胶，为缩短操作时间，可以直接倒或者用移液枪转移，推荐大容量的移液枪（比如国产大龙5毫升的，便宜又好用）。然后是压胶，我习惯用95%的酒精，我也用过纯水，感觉纯水压没那么好，由于水的密度较大，会把分界处的胶压得膨大。静置20-25分钟后（确保胶已经凝固，可以多预留一点胶在烧杯或离心管中用来指示胶是否已经凝固）把酒精倒干，用吸水纸吸出多余的酒精（注意纸尽量不要触及胶）。然后配压缩胶，同样的操作，关键是梳子要插得快，要小心防止梳子下产生气泡，然后静置30分钟，然后尽快浸泡于超纯水或者电泳液中，或者撒点纯水在玻璃板上用保鲜膜封包，然后4度保存（建议保存时间不要超过3天，时间长胶中的聚丙烯酰胺会部分水解，影响胶的终浓度）。如果是当天跑胶，我会等上层胶凝2个小时再用，但要注意防干燥缩水，加完上层胶30分钟后先浸泡于液体中。所以我一般提前一天制胶，第二天就用。
1.3 蛋白电泳
1.3.1上样前准备
把玻璃板和胶组装到电泳芯上，注意密闭性（否则漏液），如果内槽漏液就不是匀强电场了，最后条带可能就不是一条直线。然后内槽倒满电泳液，拔梳子，这一步要小心，梳子要两边一起缓缓往上拔出，然后观察泳道内有无脱落的胶粒或者胶丝，有的话用1毫升注射器吸出。然后从冰箱取出蛋白样品，解冻。准备振荡器。
1.3.2 上样和电泳
注意，上样后蛋白会开始慢慢在胶中弥散，所以上样越快越好。我习惯先上蛋白Marker,再上蛋白样品，蛋白上样前确保样品完全解冻和充分振荡（推荐使用振荡器振荡），吸的时候没有拉丝即可，建议上样前五分钟把样品从冰上取出来，不然样品中SDS可能会结晶析出，从而影响电泳效果。上层胶80V 25-30分钟，下层胶120V 60-65分钟。以下是正常电泳示例：
1.4 转膜
1.4.1转膜前准备
我会在电泳结束前60分钟准备，把转膜液配好置于4度冰箱预冷，然后裁膜，准备转膜装置，准备碎冰和冰砖。转膜前把膜置于甲醇溶液中活化1分钟，然后转移至转膜液中平衡3分钟后备用。
1.4.2 转膜
组装转膜三明治夹，这一步很关键，最重要的是胶和膜之间不能有气泡且膜与胶要保证贴合紧密（否则会翻车，详情见条带异常部分），可以加多点转膜液泡着。组装好后加满转膜液（快要溢出外槽），设置电源参数，我习惯用恒流转膜，200-280毫安，1-2.5小时，根据分子量定，如50KD的分子用60分钟就够了。如果一个电源带两个转膜大槽即四块胶，我就会用恒压70-110V。这个过程最重要的是做好降温。这里简单说一下蛋白分子量与玻璃板厚度，分离胶的浓度，转膜电源参数的选择问题。如果是能用1毫米的玻璃板就不用1.5毫米的，因为转膜是在电场的作用下蛋白分子从胶上迁移到膜上，1毫米胶的蛋白迁移距离要比1.5毫米的短1/3。选择更薄的胶可以减少转膜时间，从而减少发热，以免胶变形，条带也会更好看。然后是分离胶的浓度，如果是150—200KD的分子选10% 以下的的分离胶，200—300KD的选8%的,300KD以上的选6%的，小于30KD的200mA 30分钟，30-100KD的按分子量的数值算，如70KD，250mA 70分钟；100-150KD的250mA 100分钟；150—300KD的分子转膜条件用280毫安(以上均是对于1.0mm的玻璃板来说的，1.5mm的要适当延长时间)，120分钟足矣，前提是胶的浓度相适应。
1.5 封闭孵一抗
1.5.1 封闭
转膜结束后，把膜先用TBST泡洗两遍再用5%脱脂奶粉或者BSA室温封闭1-2小时。注意一定要让蛋白面充分接触封闭液。
1.5.2 孵一抗
脱脂奶粉封闭的话，要用TBST泡洗三遍再转移至一抗溶液中，BSA封闭的可以直接转移至一抗中。如果膜的宽（膜是一个长方形，这里的宽与长相对应）不大于8毫米，我习惯置于15毫升离心管中孵育，两条膜"背对背"式放置于一个管子里（3毫升液体即可）。如果大于8毫米，就用普通的5格的一抗孵育盒（4毫升即可）。4度过夜，一般是12-18个小时，注意放置水平，最好用摇床。内参等蛋白丰度很高的如果孵久了可能出现条带连在一起的情况，这时可以缩短孵育时间或者降低一抗的浓度。
1.6 孵二抗显影
1.6.1 孵二抗
室温一个小时足矣。这步要注意的是建议用5%BSA或者脱脂奶粉稀释二抗，这样背景会干净许多。也要注意膜的蛋白面要充分接触二抗溶液，我一般一条膜一个槽地孵。
1.6.2显影
这一步有个细节可能有些同学没注意到，就是ECL发光液要与HRP反应一分钟后显影效果才会更好，还有要注意的是显影液要均匀覆盖，一般第二次显影（加新的显影液）比一次好看。
2. 制胶技巧
说到WB制胶，相信很多同志都有说不尽的"翻车"故事。俗话说的好，工欲善其事必先利其器，SDS PAGE凝胶就是我们做WB要利的器，因为高质量的胶是跑出漂亮条带的重要前提之一。
2.1 SDS PAGE 凝胶制备
2.1.1 玻璃板梳子的清洁
先用自来水浸泡5分钟，洗洁精清洗，注意厚玻璃板两侧沟槽容易残留胶，可以用尖锐的东西轻刮，然后用自来水冲洗干净泡沫，再用纯水冲洗即可，37度烘干或者吹风筒吹干，注意别用热风长时间近距离吹，厚玻璃板两侧的边条是用粘胶粘在一起的，高热会使粘胶融化，久而久之可能引起密闭性不良甚至边条脱落。
2.1.2 制胶试剂准备
超纯水，30%丙烯酰胺，pH8.8Tris-HCl，pH6.8Tris-HCl，10%SDS，10%过硫酸铵（APS），TEMED，还有95%酒精（压胶用）。注意试剂的有效期，是否澄清透明，若有沉淀或晶体析出，请更换。30%丙烯酰胺注意避光4度保存。pH8.8Tris-HCl和pH6.8Tris-HCl容易出现沉淀，另外注意这两个试剂有两个浓度的，分别是1.0M和1.5M，根据你的配方表来买。10%SDS低温（4度以下）时容易结晶析出。APS化学性质活泼，常温下暴露于空气下容易变质失效，一般建议配好后分装冻于-20度冰箱。TEMED气味恶臭，挥发性强，具有神经毒性，使用时屏住呼吸，在通风的环境下使用，注意密闭避光保存于4度。
2.1.3 制备分离胶
按照配方表依次加入相应体积的试剂（1.0mm玻璃板一块胶总体积5.0ml，1.5mm玻璃板一块胶总体积7.5ml足矣），加完SDS后加APS前可以先混匀，然后迅速加入APS和TEMED,马上混匀（手摇或者振荡器摇匀），灌胶，注意胶的高度，要留有足够的空间给压缩胶，一般压缩胶的深度要求是梳子下缘再往下1厘米左右。然后用95%酒精压胶，注意加酒精时要缓缓注入，并且要边加边移动枪嘴，以免酒精在同一位置冲出一个凹陷。室温静置25分钟
2.1.4 制备压缩胶及插梳子
先判断下层胶是否已经凝固，然后倒掉酒精，再用吸水纸吸干残余酒精，注意纸不能戳到胶面。然后按步骤3操作，混匀上层胶试剂后迅速灌胶，可以直接倒，但要注意别倒多了导致其他玻璃板不够，然后迅速插梳子，一次性操作，不可拔出再插。室温静置20分钟
2.1.5 凝胶的暂存
根据剩余在离心管中的上层胶是否已经凝固来判断玻璃板中的上层胶是否已经凝了。确认无误后小心取下玻璃板，用保鲜膜包裹，每块玻璃板分别包，然后浸泡于纯水中置于4度冰箱保存。一般不要放置不要超过一周。
2.2 常见翻车点及其对策
2.2.1 漏胶
90%以上都是由于玻璃板没对齐所致，技巧之一是:玻璃板一定要干燥，因为有水玻璃板会吸得很紧，不容易对齐。另外手法技巧是:一手食指指腹按压厚玻璃板一侧上缘，拇指指腹按压薄玻璃板同侧上缘，两指向下按压的同时另一手锁上同侧锁扣，同样的手法锁另一侧。另外漏胶的原因可能是玻璃板底部缺损，厚玻璃板边条密闭性不良，塑料夹子太松等。豪不夸张地说，本人自从发现这个技巧后再也没有遇到漏胶了，所以极力推荐给大家。
2.2.2 胶不凝
99%以上都是因为APS失效了，注意事项在第一部分的步骤2中详述过。其他原因也可能是TEMED失效或者胶没凝好就被晃动过了。
2.2.3 胶凝得不均匀
玻璃板没洗干净，表面有灰尘等杂质，试剂有沉淀，没混匀，加酒精冲得太快，酒精没干透等。
2.2.4 胶中有气泡
两种情况，一是下层胶有自底部向上出现的成串气泡，这是由于胶垫材质(类似海绵，胶垫在被挤压时气体冒进胶中)所致，改用实心的软胶垫或者加一层保鲜膜。另一种是梳子下缘有气泡，这是梳子插得不好，技巧是先插一侧，再插另一侧。
（第一种情况示例）
2.2.5 上层胶边缘有缺损
这是由于该侧的厚玻璃板边条密闭性不良所致，原因在第一部分的步骤1提过，也有可能长期使用粘胶被腐蚀所致。
2.2.6 拔梳子后泳道有胶丝
这个问题曾经困扰本人几个月，后来看了不同公司的制胶配方表才发现问题根源。这是因为TEMED的量太多导致胶凝得太快，插梳子之前胶已经部分凝固。然后减少五分之一的TEMED即可解决这个问题，至今再没碰过类似情况了。
2.2.7 拔梳子后泳道歪了
梳子与玻璃板不匹配，不同公司生产的规格或多或少有差别，当梳子厚度比玻璃板内径稍大时，插或者拔都觉得很费劲，这时极易出现拔梳子泳道变歪，解决办法，在未灌胶前先试梳子是否匹配。
2.2.8 上层胶中电泳出现"漏样"
这个问题更是困扰过不少同行，包括本人。原因有两个，一是玻璃板与胶局部分离产生了缝隙，要注意取玻璃板（带有胶）时小心，不能有分离玻璃板与胶的动作；保存胶时注意不要将两块玻璃板直接接触，否则在取出来时由于两玻璃板之间充满液体，在大气压下吸得很紧，分开时容易将胶与玻璃板分离；拔梳子时也要小心，动作要轻；上样时也要注意，不能将枪头插得太深，以防将胶与玻璃板撑分离了。还有一个原因跟上样缓冲液可能有关，具体机制不清楚，经验之谈而已。
最后放一张图片大家看看，这是我认为的配的比较好的胶，梳子下无气泡，分界处呈现一条笔直的折光线，各处均质透明。
3. WB常见问题分析
3.1 制胶问题
有人问，玻璃板洗干净纯水冲洗后还有水附着在表面，能不能直接配胶？我的回答:非常不推荐这种做法。原因有二，一是正文提到的，有液体两块玻璃板一靠近就吸附得很紧，不好对齐玻璃板而容易漏胶。二是，灌胶后残留的水会漂浮在下层胶表面，酒精压胶后，出现下层胶上缘会出现一种现象:上缘不是一条水平线，两端可能出现凹陷，甚至还能看到分界处凝得不均匀（折光性不一致）。所以总结一下，做实验不要总想着走捷径，该花功夫的地方还是不能偷懒。
3.2 电泳问题
部分同行可能还经常遇到"漏样"的情况，即上样后在压缩胶中电泳时出现个别泳道的溴酚蓝从底部渗漏到旁边开来，然后导致"漏样"的那个泳道的条带就会比预期的浅又窄（显影结果），影响非常大，一个泳道出问题整块膜可能都不能用了。这个问题也困扰了我了半年，查过很多资料。最近我才找到了解决办法，特地跟大家分享一下。
漏样的直接原因是玻璃板与胶分离了，导致泳道里的样品可以直接渗漏到胶与玻璃板的缝隙中。主要原因在于操作手法，尽量避免使玻璃板与胶分离的动作，比如胶还没完全凝好前尽量别用力挤压玻璃板，收胶时轻拿轻放，组装玻璃板和胶到电泳芯上时不能太用力挤推玻璃板，拔梳子前先泡在电泳液（液体润滑作用）中再竖直向上拔，上样时枪头别太用力向下挤等。还有一种可能是玻璃板质量问题，有些玻璃板不平整，或者表面不亲水。最后可能就是胶的质量问题，比如压胶的酒精还没干就灌了上层胶（导致剩下层胶界面有缝隙），还可能是APS失效导致胶聚合不佳。
3.3 转膜问题
3.3.1 小分子（小于20KD）用0.22微米的PVDF膜转膜时间长会不会转透？
我相信这个问题困扰过很多同行，我也一样。我之前查过很多资料，也问问过很多经验丰富的前辈，他们大部分都认为不会转透，只有小部分人觉得会转透。我这几天就针对这个问题展开了实验，用两层膜覆盖于胶上，发现时间较短的时候第一层膜（紧靠胶的）比第二层膜的条带浓集许多，Marker的颜色也是第一层比二层深色。如果转膜时间延长，结果就会反过来。所以，结论是，尽管用0.22微米的膜，转膜时间过长小分子真的会转透。最后我建议各位还是要注意选择适合的转膜时间，尽量短，如果必须要转稍微长点的时间（同一块胶有大分子要转的且裁胶不方便的），就放两层膜。
3.3.2 电泳完marker形状正常但转完膜marker出现涣散。
大家在做WB时或多或少地都会遇到转膜后膜上的marker出现涣散的情况，即marker形状不凝集，像笔墨在纸上晕开的感觉。这样的话，显影出来的条带也会不凝集，散开，信号低，背景不均匀且高。这个问题也曾困扰我一段时间，一开始一直怀疑是转膜降温不良所致，直到最近才找到真正的"元凶"——胶跟膜贴合不够紧密。有些三明治夹用久了会变形，一般是中部向外凸，遇到这种情况最好淘汰它。如果三明治夹未发生明显变形，极有可能是海绵用久了变得很瘪，这时最好的解决办法就是加多点滤纸或者加多一层海绵。自从我发现了原因之后再也没碰过转膜后marker不凝集的情况了，由此而产生的条带背景等问题也解决了。
3.4 显影后条带异常
3.4.1 背景不均匀（下图所示）
这是膜与胶贴合不紧所致，转完膜也能看到marker涣散。
改进办法：加多点滤纸或者加一层海绵。
3.4.2 “两端粗又深中间细又浅”（下图所示）。可能的4个原因：
3.4.2.1 转膜没做好散热，由于转膜槽中心部离外槽的冰块或者冰水混合物最远，故中心部散热最差，导致中心部蛋白转膜效率下降。
3.4.2.2 孵抗体时，有时膜呈拱形，中间向上凸时该部位的膜可能未充分浸泡于液体中，中间向下凸时该部位的膜可能直接贴壁，两种方向的结果是一致的，就是中间部的膜未能与液体充分接触。
3.4.2.3 活化前中间部膜被污染过，导致该部位的正电荷被中和了一部分。
3.4.2.4 我觉得这是最常见的一种原因：显影时，发光液覆盖不均匀，由于膜变形，在液体的表面张力和虹吸作用下，导致两端显影液分布与中间部不一致。针对第4个原因，我想到了一个解决办法。如下所示，滴加发光液后，再覆盖一张平整洁净的塑料膜（如密封袋），如此一来，显影液就基本均匀覆盖在整张膜上了，亲测有效，欢迎试用该方法。
3.4.3内参连城一条线
上图有两个问题，一是每个泳道连在了一起，为上样量过多所致。二是第二泳道该蛋白有明显的降解带。
有时我们为了跑一个表达量比较低的蛋白，会加很大的上样量，比如超过50微克总蛋白，这时我们目的蛋白可能跑出来了，但是令人头疼的问题也来了，内参连成一条线了。我最近摸索出可以解决该问题的办法，这里推荐给各位试试。就是缩短内参的一抗二抗孵育时间，比如一抗4度3-5小时，二抗常温30分钟，如果还不行就用抗体清除液洗脱三分钟后再封闭孵一抗二抗（洗脱后的一抗二抗时间就用常规的时间），这样基本能解决内参连在一起的问题，有需要的同行下次可以试试。
3.4.4 条带淬灭现象
为蛋白含量过高所致，可通过稀释显影液，缩短曝光时间，减少上样量，缩短抗体孵育时间等办法改善。
3.4.5 泳道背景高
常见原因是一抗特异性不好；蛋白提取不纯，含有较多的脂肪、核酸等；封闭不足等。
3.5 综合问题
3.5.1磷酸化小分子蛋白WB技巧
一个14KD的磷酸化蛋白我之前重复跑了接近50次，条带都不忍直视，要么只有背景，要么只有一条淡淡的几乎看不见的影，而且还要曝光300秒那种。然而今天用了自己辛辛苦苦配的5*loading buffer跑了一次，结果令我眼前一亮，当时我就忍不住惊叹了一声"哇塞，Well done！" 还有IL-1 beta,平时都是很浅很浅，今天也能有差强人意的条带了。
原因在于，我猜想是这样的，我们买的上样缓冲液都是已经加了还原剂的，这个物质化学性质活泼，容易被氧化，所以买的loading buffer不一定"新鲜"，可以肯定的是没有自己配的"新鲜"，因为我们配的都是用之前才加入还原剂的。那为什么用了"新鲜的"上样缓冲液就会跑得好？道理又是什么？我是这样认为的:还原剂的作用是打开二硫键，让蛋白质维持一级结构，这样跑胶的时候才能符合电泳的预期——蛋白质电泳迁移速率只与分子量有关，与空间结构无关。如果还原剂失效了，那么就会有部分蛋白保留一些二级结构，那就不是线性结构了，跑胶的时候这部分蛋白就会因为空间效应跑得慢，也因此可能没赶到预期的分子量位置上，所以目的条带位置上蛋白就比真实值少，条带就浅，甚至看不到。需要自配蛋白loading buffer的请看下图配方。
3.5.2 条带信号太低甚至无信号（白膜）
最近看到很多同行在咨询条带出现信号太低甚至无条带、高背景、多黑点等问题。之前我也被这些问题困扰过很久，所以今天特地跟大家分享一下我在这方面的经验，希望能对大家有所帮助。其实这很可能是样品的问题，我们知道WB重中之重就是蛋白的提取，所以提取蛋白的时候一定要仔细，千万别在这个环节偷懒。下面我以提动物组织蛋白为例，讲一下我的经验。
第一，组织块称重时一定要快和做好冷冻，不要在称量过程让组织快完全解冻了，否则溶酶体酶会被大量释放，组织蛋白会被大量降解。第二，研磨时也要在尽量低温的环境中操作，我一般在冰上用手持式电动研磨仪研磨。第三，也是最重要的一点，研磨完后冰上超声，30%的功率，超声5秒，停5秒，连续6个循环。注意事项是，用1.5mL EP管装蛋白液，至少200微升总体积，最多1000微升，太少容易产气泡，太多会溢出，工作时保证超声探头保持在液面以下4mm甚至更下（防止产气泡）。超声对提取膜蛋白和核蛋白尤其有效，其实对胞质蛋白也有好处。超声的作用是使蛋白质和脂质还有核酸分离开，使提出来的蛋白更纯，高背景往往是由于脂质和核酸与抗体的非特异结合导致。低信号和无条带可能是提取的目的蛋白结合了脂质和核酸，导致总分子量增大，不在预期的位置，所以在预期位置出现了低信号或者无条带。这个超声的好处我也经常跟我们实验室的其他同学推荐，得到一致的认可，现在我们实验室的同学们不管提组织蛋白还是细胞蛋白，胞膜蛋白，胞质蛋白还是核蛋白都采用了超声这个方法。
以上是今天的全部内容，祝各位实验顺利，早出成果，更多细节问题，可以在讨论区留言，但在讨论区回复可能不及时，若需及时回复，可以私聊，如果觉得有用，希望能留下你美好的点赞，也欢迎推荐给你身边的人，更欢迎转发朋友圈。
另外，本人还发布了其他有关科研的经验帖或疾病知识的科普知识，需要的请点击以下链接自取。
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最后编辑于 2024-08-02 · 浏览 1.6 万
