“玄学”实验-Western blot的内参你选对了吗？
一、 何为内参？
有一类基因被称为管家基因，其表达水平受环境因素影响较小，而且是在个体各个生长阶段的大多数，或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。管家基因表达的蛋白质就是我们WB实验中所说的内参。
二、为何需要内参？
在Western blot实验中，我们通常需要检测不同处理条件下的蛋白质含量变化，但由于实验条件等因素的影响，不同样品中蛋白质总量可能会存在差异，因此需要使用内参进行标准化。使用内参可以消除实验条件等因素的影响，从而准确地比较不同样品中待检测蛋白的含量变化。通俗地讲，假设我们检测到各组间目标蛋白的信号强度明显不同，可能是组间实际上就存在明显表达差异（“真像”），也可能是由于我们加载的蛋白总量不同，或者蛋白转移的效率不同等导致的“假象”。为了确保我们看到的条带趋势是“真像”，我们需要找到一种能够反映蛋白质总量的标准，也就是内参。我们将内参作为参照物，用目标蛋白信号强度除以内参信号强度，得到的结果就能更准确地反映出目标蛋白在不同样品中的表达水平。这就是为什么我们需要使用内参的原因。
三、常用内参有哪些？
1、总蛋白或者胞质蛋白内参（定位于细胞质）主要包括以下3类：
β-actin（肌动蛋白）：β-actin广泛存在于不同类型的细胞中，分子量约为42 kDa，主要位于细胞质中，是一种结构蛋白，参与细胞骨架的构建和细胞的运动等功能。
GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）：GAPDH参与细胞糖酵解途径中的反应，分子量约为36 kDa，位于细胞质中，广泛存在于不同类型的细胞中。
tubulin（微管蛋白）：tubulin是微管蛋白家族中的一员，主要参与细胞骨架的构建，包括α和β两种亚型，α-tubulin和β-tubulin分子量分别为55kD和50kD,其实际检测条带均在55kD左右，位于细胞质中。
2、胞核蛋白内参（定位于细胞核）主要包括以下2类：
Histone H3：是组蛋白家族的一员，主要存在于细胞核内，分子量约15 kD。
Lamin （包括A和B）是一种胞核内骨架蛋白，与核膜结合，Lamin A的分子量约为74 kDa，Lamin B的分子量约为67 kDa。
3、胞膜蛋白内参（定位于细胞膜）：
钠钾ATP酶(Na/K ATPase)：在哺乳动物中，Na/K ATPase的α亚单位分子量为约110 kDa，β亚单位分子量为约33 kDa。
4、细胞器内参：
线粒体内参蛋白COX IV：线粒体内膜酶复合物IV的一个亚基，分子量约为19kDa。
常用WB蛋白内参汇总
四、内参蛋白的选择策略
1、内参选择的总体策略：
首先，最重要的一条原则是，内参在样品中含量相对稳定，不受实验处理的影响，这样才能保证不同样本之间的比较是可靠的。
其次，选择与待检测蛋白在生物学功能上无关的蛋白作为内参。
最后，内参的分子量与目标蛋白质不同，易于区分。一般建议分子量相差5KD以上。
2、内参选择的步骤：
先通过权威的蛋白质数据库Uniprot（https://www.uniprot.org/） 查找目的蛋白的信息，包括细胞亚定位（用以选择提取总蛋白、膜蛋白、胞质蛋白、核蛋白还是细胞器蛋白），分子量（区分内参蛋白的分子量）。
然后根据查到的信息，确定要提取的蛋白类型（总、膜、胞质、核还是细胞器），按以下建议选择内参：
1） 如果我们提取的是总蛋白或者胞质蛋白，从β-actin、GAPDH和tubulin中选择其中1种就够了。
2） 如果我们提取的是核蛋白（使用核蛋白抽提试剂盒），那么选择Histone H3或Lamin两种之一即可。
3） 如果我们提取的是膜蛋白（使用膜蛋白抽提试剂盒），那么选择Na/K ATPase。
4） 如果是分离线粒体后提取的蛋白，可以选择COX IV。
需要注意的是,某些病理生理状态下，有些管家基因的表达会受到明显干扰。比如：
GAPDH不宜作为糖代谢紊乱和缺氧的状态下的样本的内参。
Lamin不宜用来做凋亡实验的内参。
Tubulin不宜作为经抗癌和抗真菌药处理过的样本的内参。
Lamin B不宜作为胚胎干细胞的内参。
PCNA不宜作为非增殖细胞的内参等。
对于分泌性样本，如血浆、乳汁等，由于没有完整的细胞结构，应选择分泌蛋白作为内参比如Transferrin。
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