错配修复系统（MMR）蛋白与微卫星不稳定性（MSI）检测结果小结

随着免疫治疗日趋火爆，各种相关检测层出不穷，现在主要是采用MMR和MSI两种检测方式预估采用PD-1治疗的效果。现在能够称得上伴随诊断的检测类试剂并不多，各种检测手段纷繁杂乱。今天把我整理的一些知识点和大家分享一下。

1. DNA 错配修复系统（MMR）的概念及临床意义

错配修复(Mismatch Repair，MMR) 是指在含有错配碱基的 DNA 分子中，使核苷酸序列恢复正常的修复方式。当 MMR 基因发生胚系突变或甲基化时将导致 MMR 功能下降，致使 DNA序列中的碱基错配、缺失或插入不能被修复。因此，MMR 系统是体内的一个安全保障体系，它可以维持遗传物质的完整性和稳定性。

MMR 系统在参与 DNA 修复时可涉及到多个错配修复蛋白，包括 MutS（MSH2、MSH3 和 MSH6等）和 MutL（MLH1、MLH3、PMS1 和 PMS2）两大家族。其中，MLH1、MSH2、MSH6 及 PMS2 是MMR 的主导蛋白。这 4 种主要的 MMR 蛋白中的≥1 种表达缺失判定为错配修复基因缺陷(dMMR)，全部阳性则判定为错配修复基因完整(pMMR)。

结直肠癌 dMMR 特有临床病理特征：

① 发病年龄早，dMMR 组年龄≤60 者较 pMMR组多见;

② 好发于右半结肠，在 dMMR 组发生于右半结肠(30.8%)者明显高于左半结肠(5.3% ) 和直肠(7.6% )，而 pMMR 组发生于左半结肠(94.7%)和直肠(92.5%)者明显高于右半结肠(69.2%);

③ 组织学类型以黏液腺癌和低分化腺癌多见

MMR家族成员错配碱基修复示意图

2. 微卫星不稳定性（MSI）的概念及临床意义

微卫星,即短串联重复序列,是广泛分布在真核生物基因组中的,以 1-6bp 为一个重复单元,重复次数不超过 60 次的 DNA 序列。微卫星按照重复单元的大小可分为单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重复。

微卫星不稳定性（MSI）是指由于基因复制错误引起基因组中重复序列次数的增加或丢失，导致微卫星片段长度发生了缩短或延长。一般情况下,这种错误会被 DNA 的错配修复系统(Mismatch Repair, MMR) 修复。然而,当 MMR 中的相关基因由于启动子超甲基化或基因突变等原因出现故障,DNA 复制错误无法被修复,一些微卫星位点重复单元的重复次数发生波动,进而发生微卫星不稳定。

近年来的研究表明, MSI 对林奇综合症以及结直肠癌的诊断、预后以及化疗敏感性有重要的意义。除了结直肠癌,研究人员也相继在子宫内膜癌、卵巢癌、胃癌以及乳腺癌等疾病中发现 MSI。MSI 作为肿瘤遗传不稳定的敏感指标,其检测对于肿瘤的早期诊断、预后判断、化疗敏感性判断以及高危人群的圈定等具有重要意义.

3. MMR 检测方法与特异性分析

免疫组化(IHC) 方法价廉、耗时少，病理科可以常规用于检测 MMR 蛋白，可用于小肿瘤标本检测。所以近年来大多采用 IHC 对 MMR 蛋白进行检测，并有国内外的研究显示预测 MSI状态其敏感性和特异性均＞90%，联合应用敏感性更高，因此免疫组化方法可用作一线筛查。

MLH1、MSH2、MSH6 及 PMS2 均定位于细胞核。如果肿瘤细胞核中完全缺失某个 MMR 蛋白表达，就认为是表达缺失，此时需内对照阳性(基质炎症细胞和内皮细胞核染色阳性)，如果肿瘤细胞和基质细胞均无染色时，应重复检查。有时，内对照染色强于阳性的肿瘤细胞，应当进行分子 MSI 分析证实是否为有缺陷的 MMR 系统。4. MSI 检测方法与特异性分析采用 PCR 方法检测肿瘤 MSI 状态是最早确立的鉴别 MSI 结直肠癌的分子手段，且被认为是检测 MSI 的金标准，但是实验周期较长、实验室条件要求高、价格昂贵。

1997 年，美国国家癌症研究所（NCI）建议使用由 5 个检测位点作为 MSI 标准化检测的依据。但这一组检测位点由于含有二核苷酸标记而受到限制，与其他类型的标记物相比，这些标记物对检测具有 MMR 缺陷的肿瘤的敏感性和特异性较低。检测位点的选取标准首选特异性（Specificity）强的，降低非靶向位点扩增的假阳性；然后选敏感性（Sensitivity）高的，可以有效地屏蔽背景噪音对检测结果的影响。

有研究表明，单核苷酸是检测具有 MMR 缺陷的肿瘤，并可以用于检测 MSI-H 肿瘤的最佳标记物。本项临床试验从 266 个备选位点中，选取特异性和敏感性最好的五个单核苷酸标记：BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24 和 MONO-27。此外，还添加了两个五核苷酸（Penta-D & Penta-E）标记来识别样本混合和/或污染。

5. MMR 缺失与 MSI-H 的关系

在基因组正常复制的情况下，如果 DNA 碱基发生错配，错配修复（Mismatch Repair，

MMR）系统会对其进行修复，保持其遗传信息的正确性；如果 MMR 基因发生突变，则会导致MMR 功能缺陷，不能修复错配碱基，从而使 DNA 产生遗传不稳定性，最终导致肿瘤易感。约占 5%的 MSI-H 肿瘤组织中 4 种 MMR 蛋白具有正常水平，除 4 种主要的错配修复蛋白以外，其他错配修复蛋白的缺失亦会影响微卫星的稳定性，仅根据 4 种主导蛋白的 IHC 分析就可能被误诊，这也强调了检测 MSI 状态的重要性。

另外，MLH1 启动子区甲基化会引起MLH1 蛋白缺失，是属于散发性结直肠癌的主因，如果 MLH1 蛋白完整，则可以基本排除甲基化引发癌症的可能性，对于确诊林奇综合征有重大意义。简单地讲，林奇综合征相关癌症是错配修复基因胚系突变导致的，具有家族性、遗传性特点；由 MLH1 甲基化引起的癌症属于散发性，为后天因素，不具有遗传性。

以下是一个大家比较关心的问题：① 既然 dMMR 是造成 MSI-H 的原因，为什么会出现只有 dMMR，但是微卫星状态是稳定型（MSS）；② 又或者 MSI-H，但是错配修复完整（pMMR）的情况呢？

① 正如前面所说的一样，MMR 家族有 MLH1、MSH2、MSH6 及 PMS2 等多个成员。有文献报道，某些孤立性的 MMR 蛋白（如：MSH6）缺失时，由于其功能冗余，可能不足以导致 MSI 的发生。

② MMR 蛋白的基因会发生变异，有些变异不影响蛋白的抗原结构，却能影响其错配修复功能，导致微卫星位点错配修复失败（MSI-H）。此时，用免疫组化的方法检测 MMR的结果是 pMMR，而微卫星稳定型检测的结果为 MSI-H。

总而言之，根据大多数文献的报道：MMR 和 MSI 的检测都不能达到 100%的敏感度和特异性，这和检测技术的局限性有关，但是也不排除样本质量的原因，例如：送检的癌组织量没有达到 70%会增加 MSI 检测的假阴性概率等。

6. 检测结果结论相左的原因和处理办法

对于检测结果不一致：主要原因在于取样部位和检测方法上。

取样部位：寄送到两家医院的切片的取样部位不是来源于同一部位，结果会有不一致的情况，例如：一家医院病理科检测时用的是原发灶上取样的切片，而送往另外一家医院检测的是转移灶或新发病灶上取样的切片。还有一种情况，取样组织中可能没有肿瘤细胞（细针穿刺时较常见），更换切取样本的角度或部位，有可能取到不同组织。

因此，送检切片尽量采用既往检测时采用的蜡块进行制片，并且从原蜡块的旧有切割部位重新切割制片。注意：1）暴露部分前两张切片不用；2）尽量采用蜡块核心区的连续切片。

检测方法：抗原丢失可能会导致抗体染色弱，有时医院检测没有关注内对照是否阳性，将抗原丢失或减弱的判读为阴性，进而解读为错配修复系统蛋白缺失（dMMR）。因此，如果对检测结果有异议，可以先与医院病理科确认在做免疫组化时，是否参考阳性对照。

MSI 的检测方法较为多样，目前为止还缺少统一的检测标准，这对检测结果的一致性是一个很大的挑战。如果既往为 MSI-H 的样本检测结果不一致，需要综合考虑以下三点：

① 送检样本与原检测灶样本来源的关系；

② 样本质量；

③ 原检测报告的合理性等

总而言之，肿瘤治疗任重而道远，PD-1也好，免疫治疗也罢，都只是万里长征第一步。希望各位奋斗在肿瘤治疗前线的同志们能够坚持！