“别人家的导师”卷上太空，我却看着自己KO细胞的实验进展沉默了

5月30日是第七个全国科技工作者日，神舟十六号也于当天上午发射升空，开启探索太空新征程，期待神十五与神十六航天员顺利会师。

听说此前神十六发布会间隙，作为乘组成员之一的桂海潮还不忘cue自己的学生交论文，对此，有网友戏称“天地连线开组会安排上了！”

如果导师出差还要坚持开组会，屏幕前的你会不会也为这样的师生情所感动然后开始疯狂赶实验进度，手里的细胞挑得飞起，以免导师出其不意问上一句“基因该敲的都敲完了吧？”

往期回顾

Q1: 基因敲除的sgRNA如何设计？

Q2: 如何避免脱靶效应？

KO细胞的常见问题解答

Q3 CRISPR-Cas9系统的活性检测方法有哪些?

通常我们都是采用各个设计网站预测，得到我们的gRNA，那如何能够快速、准确的验证CRISPR-Cas9系统是否能发挥作用呢？

(1)荧光活性检测法。在Cas9和gRNA的作用下，靶点位置的双链DNA会被切割形成DSB，细胞通过同源重组形成有活性的荧光蛋白，可通过流式细胞仪来检测荧光强度是否增强，以此来判断Cas9及gRNA的活性及敲除效率。

(2)错配酶法。对修饰后的靶序列进行PCR扩增过程中，会形成含有错配的DNA双链，将经过错配酶切割后的产物进行凝胶电泳，检测CRISPR-Cas9系统的切割活性。

(3)套峰检测法。对修饰后的靶序列进行PCR并测序，通过分析Spacer区域套峰情况来分析CRISPR-Cas9系统的活性。

Q4 实现基因功能缺失，我要做敲低（RNAi）还是敲除？

(1)当敲除可能会导致细胞增殖非常缓慢或停止生长，或在细胞转染后的cell pool阶段检测效率呈显著下降趋势，即可判定可能出现敲除致死的情况，建议用RNAi。

(2)由于存在部分强功能蛋白，即使表达下调了，仍然有较强的功能，如果RNAi始终做不出表型，但从有关信息推测这个基因很大可能性会出表型，建议做KO；另外，研究的目的基因处于非转录区域，或者目的基因有很强的转录效率，也是无法用RNAi进行有效干扰的，则建议做KO，且KO细胞更适合进行回补实验。

(3)最后，敲低跟敲除不是二选一的关系。当我们用RNAi做了基因敲低，观察到细胞表型的变化后，仍然可以进一步做敲除，让实验结论更加有说服性。