NCBI--Primer Blast 引物特异性检测

在实验室是不是经常听师兄师姐说引物特异性问题，但不太理解，也不会检测。那下面跟着步骤学习吧。

引物：是一段短的单链寡核苷酸，在PCR过程的退火阶段，引物与单链模板结合，DNA聚合酶沿着引物的3末端向后进行DNA的合成。引物与模板的结合遵循碱基互补配对的原则，因此，当退火温度不合适或引物设计不合理时，引物会结合到模板的非目标区域，从而导致其他片段的扩增。

引物特异性: 所谓引物特异性，就是引物结合模板正确位置的能力，或者避免结合非目标位置的能力。引物的长度、GC含量、碱基分布、Tm值等性质，均会影响其特异性。

为什么能在NCBI上比对引物特异性？

NCBI收录了诸多物种的基因组DNA、编码序列mRNA以及其他相关核酸序列的数据。使用Primer-Blast进行比对，首先要输入一对引物序列，并选择序列所属数据库。此时系统将在该数据库中对序列进行查找和对比，并将引物可能结合的位置进行记录，一旦结合位置处于两条链并且产物大小符合要求，系统就会将这种情况列举到结果中。需要注意的是，结合模板的引物不仅是一条正向一条反向，也有可能是两条正向或者两条反向引物。

NCBI--Primer Blast 比对步骤:

1.打开NCBI，进入Blast，网页如下：

点击上图红框标记的Primer-Blast，进入如下界面，在界面引物序列处，将正反向引物序列粘贴进去，5’-3’方向。产物大小默认为70~1000，可以根据实际情况进行调整。

选择相应的物种和参考数据库。

首先，要确保Specificity check一栏中已经打勾。Search mode一般选择Automatic即可。

物种：人源的基因选择Homo sapiens(taxid:9606)；小鼠的选择Mus musculus (taxid:10090)；大鼠的选择Rattus norvegicus(taxid:10116)。

参考数据库范围：要看PCR的模板是什么，如果是提取的RNA反转录后得到cDNA就选择Refseq mRNA（针对mRNA）或Refseq RNA（针对mRNA和lncRNA）；若模板是基因组，则应该选择Refseq representative genomes。在Exclusion行中，可以对预测的序列以及环境/不可培养样本序列的干扰。

选好数据库和物种后点击页面左下角的Get Primers，系统进行分析，一段时间后会进入如下页面：（该页面以一对人EGFR的qPCR引物为例）

上图显示了多个结果，原因是EGFR基因有多个转录变体，这对引物能够将下方显示出来的变体都检测到。

每个结果分为多个部分：

第一部分为比对出来的基因结果；对于mRNA数据库，提供了该mRNA的NM号，对于基因组数据库，则会显示出基因组编号，点进去会出现预测的产物序列。

第二部分为预测出来的产物大小。

第三部分为正反向引物和模板的结合形式，“点”代表该位置的序列和模板完全互补配对。

非特异性结果如下：

如上图，红框位置说明该位置跟模板不匹配，这种属于潜在的非特异性扩增结果,当然最好的情况是与目的模板匹配，而无其他的模板匹配。

引物特异性是引物设计需要考虑的首要原则，否则引物GC含量和Tm值再好都没用。