分子克隆实验基础和软件教学（一）

一、 看这篇文章你能获得什么？

1. 稍微提高你对质粒的理解；
2. 获得一定程度的分子克隆实验基础；
3. 学习简单的载体构建软件操作技能；
4. 提供一些载体构建相关网站

二、提高你对质粒的理解

Q1. 什么是质粒？

一般我们常用的工具质粒是来源于原核生物（如细菌和酵母等）的独立于其基因组的环状DNA，对原核生物的生存起不到决定性作用，一般是提供一些补偿型的基因（如增强感染性和提高代谢等），电镜下如下图，就像是散乱的皮筋。对于基因编辑而言，质粒是非常重要的基因运载工具，常用来将外源基因导入目标细胞内。

图片来源：中国百科网

Q2. 装在管子中的质粒以几种形式存在？

由于质粒在提纯和保存以及DNA分子的天然特性，你实验室里储存tube中的同一管质粒，应该是由3种类型组成的，它们分别是：

A: 分子形态完，DNA链没有发生切割的，超螺旋形式。这种类型分子能量释放最少，内部化合键结合更为紧密，所以一般你试管中95%以上都是这种类型的质粒。可以想象为用手揉搓过的皮筋或是麻花。

B: 有一条DNA链发生切割的，开环形式。这类分子发生切割，结构不稳定，超螺旋的形式被打开，数量和C互补。可以理解为刚拿出来的新皮筋。

C: DNA双链发生切割的，线状形式。可以理解为被剪开的皮筋。

由于分子形状的差异，它们在琼脂糖电泳时收到的摩擦力不同，泳动速率不同导致在质粒DNA电泳时最终位置的不同。

泳动速度：A>B>C

可以跟随以上提到的原理推测下图中三类分子最终的位置：

图片来源：我自己

Q3： 质粒提取的一般步骤、原理和注意事项？

不论你使用的是哪种类型的试剂盒或者哪种提质粒原理，现在商业化的质粒提取试剂和一般都具有如下几个步骤（具体可能视盒子类型和定位稍有差别）：

1.摇菌 一般将你的单菌落或冻存的甘油菌加入TB或LB培养基中摇12-16小时；这一步的目的是将携带你质粒的大肠杆菌快速扩增起来质粒的拷贝数；摇菌尽量不要超过16小时，抗生素容易失效导致杂菌扩增起来。

2.离心 离心这边没有太多说的，其实没有固定的转速4000-6000g，离心6-10min内都可以，一般在离心3min的时候90%的菌体已经被收集在管底。

3.重悬和去RNA 这一步加的试剂常称为P1或E1等，目的在于微微打开菌体出去菌体表面和内部的RNA，减少质粒被RNA污染的概率；这一步需注意在重悬时候一定要充分管底不要有结块的菌体，加入 RNA酶E1通常需要储存在4℃冰箱内，随用随取。

4.完全裂解菌体 试剂名称常称为E2等，目的在于利用强碱完全破坏细菌膜和壁成分，使其完全释放内容物；注意混匀的操作要柔和，时间不宜过长，否则会因为细菌的基因组DNA的破坏而影响纯度。这一步处理不好会导致A260/A280偏高，会大于1.8。

5.中和裂解 常称 E3，由于大部分生物大分子可以溶解在强碱中，加入酸后，大部分的蛋白和大分子核酸都会被迅速沉淀出来，会留下一些小分子量的核酸和蛋白质，注意操作轻柔，原因同上。

6.沉淀DNA 常称为E4，主要成分为异丙醇，会使DNA分子（此时主要是质粒DNA）沉淀出来，会在过柱子的时候留在柱子上；主要注意的是混匀和静置。可能需要反复过柱子保证所有体积都过完。

7.去除内毒素 常为E5，这个一般为专门的低内毒素质粒提取试剂盒才会有，在于去除细菌细胞壁中的一些脂多糖类分子，因为这些分子可能会对哺乳动物产生毒性；但是，质粒提的不好，一般和这一步无关，我用的不去内毒素的试剂盒，提的好的话对转染也没有什么影响。

8.洗涤残余蛋白质 一般为PW2，经常需要反复洗2次左右，目的在于去除残留在柱子上的蛋白质，增加质粒纯度，这一步处理不好会导致A260/A280偏低，会小于1.8。

9.洗脱 不同盒子中配置的洗脱液可能会有不同，但是，但是，但是，用超纯水足已，想要提高产量的话可以在洗脱前将水加热到60℃，反复洗脱1次。

10.保存 4℃放置一个月不会有什么问题，长期不用的还是储存在-20℃冰箱为宜。

先更新到这里，