【原创】实时荧光定量PCR中内参基因怎么理解

做实时荧光定量PCR，进行目的基因的半定量分析时，需要引入内参基因。什么是内参基因呢？简单地说，就是拿来做参照的基因。那么，为什么要引入内参基因才能够做半定量分析呢？

我们来看一个简单的例子。

如上图所示，A和C分别代表了实验组和对照组的细胞。靶基因在A和C中均有表达。我们研究的核心问题是，实验因素对靶基因的表达有没有影响，这种影响直观地体现一下，就是我们这个例子，靶基因在A和C中的表达有没有不同。 有人会想说，这个问题很简单啊！直接对A和C细胞靶基因的表达指标mRNA做定量检测不就行了吗？听上去，是好主意，但这个方法似乎是定量分析的范畴了，而且做定量分析还需要引入标准品。关键是，即使你做了定量分析，也说不清楚靶基因在A和C这两个细胞中的表达有什么不同。为什么这样说呢？因为极有可能，在接受到实验因素的处理之后，A细胞整体的基因表达水平都升高了，里面大多数基因的转录都比正常情况下表现得更加活跃，而靶基因可能正是这其中一种。所以，即使A细胞中靶基因的表达量比C细胞要高，也不能说是实验因素诱导了靶基因的表达，因为我们无法回避细胞整体水平的影响。

所以，直接把A细胞和C细胞拿来作比较，似乎不可行。

所以，我们需要引入内参基因。

现在我们为实验组引入内参基因B，为对照组引入内参基因D。A和B细胞的生存条件是一样的，都接受了实验因素的处理，而C和D的生存条件是一样的。我们可以先拿A中的靶基因与B中的内参基因作比较，即使实验因素处理后，细胞整体的基因表达水平发生变化，也可以通过内参基因B而得以消除。为什么呢？因为整体对大多数基因的影响可能就是（不能绝对化），你高，我也高，你低，我也低。大家都会受到整体的影响。但我们现在要比较细胞A和细胞C中靶基因的表达量，所以，我们要尽可能把这个整体水平的影响消除掉，那么一个最好的办法，就是先拿A的靶基因和B的内参基因比一下。两者都受到了整体水平的影响，这样一比，A中的靶基因相对于B中内参基因的表达情况就很明显了，我们把这个表达差异称之为P。然后，我们也拿C中的靶基因和D中的内参基因作一下比较，就可以知道C中的靶基因相对于D中内参基因的表达情况，我们把这个表达差异称之为Q。最后，我们再拿P和Q进行比较，就可以间接地知道，细胞A和细胞C中靶基因的表达差异了。所以，内参基因是在细胞A和细胞C之间起了一个中介作用。

除了细胞整体表达水平可以导致细胞A和细胞C中靶基因差异之外，在提取基因的过程中，在加样的过程中，也可能导致差异，所有这些差异让细胞A和细胞C中的靶基因失去了直接的可比性。而无论这些差异是怎么导致的，无论这些差异是让样品中靶基因（不管是实验组，还是对照的）的mRNA变得更大，还是更小，都可以通过内参基因来进行平衡。因为对同一个样品来说，内参基因和靶基因具备了完全相同的反应条件，它们面临的模板是完全一样的，它们在反应过程中会有不同的CT值，只与内参基因和靶基因最初的表达差异（就是说各自的mRNA不一样，从而导致了各自的cDNA不一样）有关，而与加样多少无关，与样品浓度无关（要注意这是对同一个样品来说，对于不同的样品，模板浓度越大，PCR时荧光数据当然更容易达到阈值，CT值当然是更小的）。不管各个样品中原来的模板浓度情况如何，底子是不是相同，都可以通过内参基因让它们归一，让它们具备可比性。