想做KO细胞，怎么偏遇上个“一身反骨”的基因

今天逛某书的时候看一位网友提及她敲除了细胞里的某个基因，结果转录水平竟然增加了！简直是对这个“反骨基因”哭笑不得~

想必大家在进行KO细胞项目的过程中也遇到了许多问题而百思不得其解，状况可谓是“奇奇怪怪，没有脑袋”。那么接下来，我们就逐一梳理，一起来看看KO细胞构建中的常见问题解答吧~

Q1: 基因敲除的sgRNA如何设计？

在CRISPR-Cas9系统中，sgRNA通过碱基互补配对原则引导Cas9蛋白酶至基因组特定的靶序列上，Cas9蛋白与PAM序列结合后便可对靶位点进行切割，形成DNA双链切口。sgRNA设计的合理与否，对于CRISPR-Cas9编辑系统的切割效率，甚至最后能否得到KO细胞具有重要影响。目前虽然有诸多高效快速的gRNA设计工具，但我们仍需了解基本的设计原则才能更好地做出判断。sgRNA的设计需要遵循以下原则：

1. 不影响其他基因，尤其是编码蛋白的基因。挑选靶区域时应避免选择与其他基因重叠的区域。

2. 尽可能影响所有的转录本，敲除位点最好在编码区的前50%，但避免敲除ATG所在外显子或ATG之前的外显子。

3. 片段敲除的sgRNA设计在内含子上，这样能敲除整个外显子区，避免翻译出残留蛋白。敲除区域前后序列尽量简单，方便后续的PCR鉴定。同时敲除的外显子编码序列之和为非3的倍数，使靶区域后面的序列发生移码。

4. 在设计sgRNA时要综合考虑候选编辑位点的序列、位置、正负链、GC含量、潜在的脱靶位点等信息。例如靶点的GC%尽量不要低于40%，靶点序列GC%偏高（50%~70%）有较高的打靶效率；靶点内不要有连续4个以上的T碱基，避免形成RNA Pol III的转录终止信号等。

Q2: 如何避免脱靶效应？

研究表明，sgRNA 通常会与基因组DNA发生一定概率的序列错配，从而引起非预期的基因组编辑，即所谓的脱靶效应（Off-target effects）。为了尽可能避免脱靶效应，可以通过以下几点进行优化：

1. 提高sgRNA特异性

在设计sgRNA序列时，可选择GC含量在50%~70%，与靶基因序列之外的基因组DNA同源性较低的sgRNA序列，同时还可以选择在sgRNA的5’端增加2个鸟嘌呤，来提高sgRNA的特异性。你也可以进入赛业生物官网的Smart-CRISPR™细胞基因编辑系统，智能化计算得到低脱靶高效率的gRNA；如未查询到所需细胞/基因，则可以定制KO细胞服务，快至4周。

2. 控制Cas9-sgRNA用量

通过控制Cas9蛋白或sgRNA的表达量来减少脱靶效应，细胞中持续表达Cas9将增加脱靶风险，因此可以通过Cas9蛋白的抑制剂来降低Cas9活性，降低脱靶效应。尽管通过调节sgRNA和Cas9浓度可降低脱靶风险，但浓度降低后，相应的基因组编辑能力也会减弱，要根据实际情况选择合适的gRNA和Cas9复合物比值。

3. 改造Cas9

通过对野生型Cas9进行改造提高CRISPR-Cas9系统的特异性，可将Cas9中的一个酶切位点失活，得到突变型切口酶，由于突变型Cas9只能对单链进行切割，因此需要2条sgRNA同时引导，在DNA不同的链产生2个相近的切口，才能引起双链DNA断裂。只有2条sgRNA均发生错配时才会发生脱靶，这极大降低了脱靶效应。

4. 选择合适的递送载体

目前Cas9可以通过DNA质粒、病毒和蛋白质三种方式传递到靶细胞中，利用Cas9/sgRNA核糖核蛋白（ribonucleoproteins, RNPs）递送系统不会在被编辑的细胞基因组中插入外源DNA序列，可有效减少脱靶效应。