一文搞定shRNA实现基因敲低（knockdown）（以pLKO.1质粒为例）
1 基本原理
1.1 RNA干扰技术
RNA干扰(RNA interference, RNAi) 现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA(double strand RNA, dsRNA) 导入细胞后，利用载体把shRNA导入细胞，载体中的U6或H1启动子确保shRNA的表达，shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上（RNA induced silencing complex，RISC），该复合物能够结合到目的mRNAs并将其降解，从而产生相应的功能表型缺失。
RNAi提供了一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段，有助于研究该基因在生物模型系统中的作用，是研究基因功能的重要工具，并且逐步成为病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤等的基因治疗研究的一种手段。现今发现的主要起干扰作用的RNAi主要有两类小分子RNA：一类是microRNA（miRNA）；另一类是siRNA （small interfering RNA）。
siRNA制备的方法一般有:化学合成siRNA，哺乳动物细胞载体shRNA克隆和慢病毒载体shRNA克隆。
利用慢病毒构建的shRNA与化学合成siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比。一方面可以扩增瞬时表达的载体使用，另一方面，lentivirus-shRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞，悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
Dicer酶是一种核糖核酸内切酶，术语RNaseⅢ家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者转基因，病毒感染等方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为21-23bp的双链RNA（dsRNA），每个片段的3’端均有2个碱基突出。Dicer作用机制一般分为两步，首先是Dicer介个到dsRNA，dsRNA被建工程许多断片段，每个片段约22bp；其次是22nt siRNA通过与PAZ与含有argonaute蛋白结合，而RNaseⅢ与后者形成多个亚单元复合物，使得这22nt siRNA特异性的决定靶基因降解。22nt siRNA被称为引导RNA，它可将多个单元复合物引到靶基因mRNA处，因为有引导siRNA的作用，所以只要有少量的dsRNA就可以引发大量的切割mRNA反应。
1.2 认识pLKO.1质粒
pLKO.1是由TRC选择的能够进行复制的慢病毒载体用于表达shRNA，pLKO.1能够直接转染进入细胞也可转变成病毒颗粒感染后续的靶细胞。pLKO.1一旦引入细胞嘌呤霉素（puromycin）基因得以表达，可进行稳定筛选。
Addgene（http://www.addgene.org/tools/protocols/plko/）
pLKO.1质粒将在“shRNA Construct”部位构建shRNA，该部位可以利用AgeⅠ和EcoRⅠ进行酶切后，产物大概有1.9kb（质粒填充碱基）。然后将shRNA引物克隆至pLKO.1。
U6启动子：人U6启动子能够调节RNA聚合酶Ⅲ转录形成shRNA的转录本。
cPPT：在转染进入靶细胞后，cPPT能够促进整合前的载体进入细胞核，以促进转染效率。
hPGK：人磷酸甘油酸酯激酶启动子能够调节嘌呤霉素的表达。
f1：f1细菌初始复制点。
Amp R：安卡青霉素（ampicillin）基因用于在细菌细胞中选择pLKO.1质粒。
pUC ori：pUC 细菌复制点。
1.3 shRNA的设计
利用赛默飞公司提供的设在线设计shRNA的网站，进行靶基因的shRNA的设计。（https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/sort.do#__NO_LINK_PROXY__）
3.1以SLC39A8基因为例利用Thermofisher设计shRNA oligos
第一步查询SLC39A8在NCBI上的mRNA登录号（一般选择最长的转录本或者研究最多的转录本）
在NCBI上查询到SLC39A8基因的mRNA accession number为NM_001135150
第二步登录赛默飞公司shRNA设计网站寻找shRNA
Forward oligo: 5’ CCGG—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense—TTTTTG 3’
Reverse oligo: 5’ AATTCAAAAA—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense 3’
3.2以SLC39A8基因为例利用Sigma设计shRNA oligos
First step：impute gene symbol or gene sequence
Second step：seek target gene symbol
Third step：select shRNA design oligo
Four step：choice validated shRNA oligo（provide forward oligo）
Five step：copy shRNA forward oligo and maker sense，anti-sense and enzyme sites of target sequence
Sigma forward shRNA sequence：
3.3 shRNA送公司合成
合成的引物名称一般命名为shRNA1-F/R等，引物方向是5’到3’一般不需要调整，在网页设计的时候已经将方向调整为5’到3’，只需要分清楚forward oligo和reverse oligo即可。碱基数目都是恒定的：21bp sense+21bp antisense +6bp loop环+ 4bp AgeⅠ/4bp EcoRⅠ+ 6bp Term。
4 设计shRNA引物退火（Annealing）
4.1 shRNA引物退火体系
4.2 shRNA引物退火反应
或者：
或者：
pLKO.1质粒酶切
5.1 pLKO.1酶切
5.2 酶切产物回收
5.2.1 pLKO.1酶切产物回收
使用0.8％的琼脂糖对酶切pLKO.1进行回收，电泳条带有5kb和2kb（pLKO.1 shRNA插入位置填充的其它序列），回收5kb条带即可。回收时用30μL的ddH20稀释胶回收产物即可，用紫外分光光度仪测量胶回收产物的浓度，一般使用长波UV测量，因为短波UV对DNA损伤较大。
5.2.2 pLKO.1酶切产物回收
直接使用DNA/PCR/酶切产物胶回收对产物进行相应处理，回收所需目的片段：
1、 DNA/PCR/酶切 产物 加入5倍体积的PB
2、 CB2柱子加入500uL BL试剂处理
3、 DNA/PCR/酶切转移至CB2柱子中离心，12,000rpm 1min
4、 600uL 清洗柱子，室温放置2min效果更好，12,000rpm 1min
5、 600uL 清洗柱子，12,000rpm 1min
6、 空甩柱子，12,000rpm 2min
7、 室温放置5min或者烘箱放置2min彻底干燥柱子
8、 加入50uL ddH2O作用柱子2min，12,000rpm 2min
9、 检测回收片段浓度（一般＞30ng/uL 比较好）
6 pLKO.1 shRNA连接转化
6.1 pLKO.1与shRNA的连接
对于敲低实验，一般来讲会构建多个shRNA，因为一个shRNA就达到敲低的效果的概率很低，一般是构建2-3个shRNA。转染的时候一般会转染2-3个shRNA + 阴性对照 pLKO.1 + 阳性对照 PCDH。
6.2 pLKO.1与shRNA连接产物转化
1、使用2μL的连接产物转移至DH5α感受态细胞中（冰浴25-30分钟，42℃热激45-90秒，冰浴5分钟）
2、使用600μL的 ampicillin-free 的LB在37℃复苏1-2小时
3、离心菌液，留存100μL的 LB重悬菌体沉淀，后涂布至含有ampicillin的 LA板中
6.3 阳性克隆的验证
1、挑选3-5个LA板的单克隆菌落，利用10μL LB（Ampicillin）重悬菌落，然后利用1-2μL菌液进行PCR验证，经过电泳检测是否含有目的条带。
2、挑选3-5个LA板的单克隆菌落，利用600μL LB（Ampicillin）培养菌落不低于6小时后提取DNA，利用AgeⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，看是否包含有目的条带。
3、将第二步获得的菌液或者是DNA送测序，测序结果是否包含咱们的目的shRNS序列。
6.4 去内毒素/小提中量提取目的质粒
将阳性克隆利用25-35ml LB（ampicillin）培养过夜（12-16小时后），然后利用去内毒素/小提中量试剂盒提取目的质粒。
7 shRNA敲低质粒产生慢病毒颗粒（lentiviral particles）
7.1 HEK293T细胞的培养
7.1.1、复苏392T细胞
1.1 将细胞从液氮/-80℃中取出，如果细胞间和细胞冻存的实验室举例较远可用液氮盒子/冰盒盛放取出的293T细胞。
1.2 将细胞冻存管2/3一下的部位放入37℃水浴锅中进行解冻，在解冻的过程中需要不停的晃动冻存管，以保证冻存的细胞均匀受热，37℃水浴锅中解冻时间控制在一分半钟较好。
1.3 将冻存管中的细胞悬液利用800-1200rpm转速离心5分钟。
1.4 倒掉细胞冻存液，然后利用1ml培养基（DMEM +10％ FBS）重悬细胞沉淀，后转移至25cm2培养皿中/30mm培养皿中。
1.5 37℃ 5％ CO2 潮湿的细胞培养箱中培养（30mm培养24小时后可传代培养，25cm2培养瓶一般培养36-48小时后可传代培养）
1.6 将HEK293T传代至10cm的培养皿中进行扩大培养
1.7 根据需要病毒颗粒的量决定培养HEK293T细胞的量
（补充材料：1. HEK293T传代比例为1:3/5，第2-3天即可进行下游实验；2. 1cm2培养皿大概有3×105cells，可推测10cm2大概是1×107cells。）
7.1.2 HEK293T病毒包装
Day1：
10cm培养皿细胞1.5×106时，或者细胞融合率达到70-80％（超过95％以后转染效率急剧下降）时候可进行转染，转染前一天晚上/提前至少6小时，将HEK293T细胞的培养基更换为无双抗的培养基。
Day2：
一般在下午进行转染工作，因为转染试剂至少要和细胞作用12-15小时。转染的质粒和操作如下表（表5）。混合好的质粒需要缓慢地均匀地加入到10cm培养皿中。37℃ 5％ CO2 潮湿的细胞培养箱中培养12-15小时。
Day3：
更换培养基，利用DMEM+10％FBS+青霉素/链霉素（penicillin/streptomycin），37℃ 5％ CO2 潮湿的细胞培养箱中培养24小时。
Day4：
收集培养基（包含有病毒颗粒）保存在4℃培养箱中，然后计入含有抗生素（antibiotics）的培养基，37℃ 5％ CO2 潮湿的细胞培养箱中继续培养24小时。
Day5：
再次收集培养基（包含有病毒）与第4收集培养基放在一起，然后利用1250rpm离心5分钟，这样子可以除去无心收集到的HEK293T细胞。
培养基利用0.45μm过滤嘴除去细胞，不要使用0.2μm的过滤嘴，因为0.2μm会损伤病毒。
避免反复冻融（freeze/thaw）病毒，病毒要么立即就使用了，或者进行分装。
7.1.3本实验室病毒浓缩的办法：
1、将病毒悬液（细胞培养基）收集，利用1250rpm，5min 后，去除细胞碎片或者细胞；
2、利用0.45μm的过滤器对病毒悬液过滤纸离心塑料管中（塑料管一放置超速离心机专用离心管中）；
（备注：塑料离心管是本实验的，使用前后均需要在75％乙醇浸泡。使用前浸泡15-20分钟，然后转移至生物安全柜中倒扣，不需要用用紫外照射。）
3、将20％蔗糖（用PBS稀释）4ml（根据实际情况而定）作为垫底液，轻轻的添加至塑料离心管的底部，然后小心的将病毒上清液添加至离心管蔗糖垫底液上；
4、将盖子扣在对应的离心管上，轻轻拧紧于电子天平称重（精准度0.1g），对于不足的使用PBS补充，1ml PBS = 1g；
5、按次序将所有 6个离心管放入超速离心转头中，执行100，000/ 125,000g X 2h/1.5h；
6、小心将管子从转头中取出。倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置 10 分钟使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底应当有可见的沉淀。
7、每管中加入适量1ml不含钙和镁的PBS洗下沉淀。
8、将超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
9、在4 ℃ 溶解2小时每隔20分钟轻轻震荡。
10、4 ℃，500g 离心1分钟，使溶液集中于管底。
11、用 200μL移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个SW28 离心管中。
12、集中后的病毒悬液分装成50μL每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80 ℃ 。
8 确定最佳的嘌呤霉素（puromycin）浓度
8.1 目标细胞的准备
1、准备好细胞，在传代以后至少要37℃ 5％ CO2 潮湿的细胞培养箱中培养过夜。
2、目标细胞必须达到80-90％融合率（confluent）放可加入puromycin进行筛选。
8.2 puromycin筛选目标细胞
筛选办法1：
首先是准备好puromycin，然后在使用的时候，保证puromycin的终浓度在1-10μg/ml以1μg逐步增加puromycin。
接着就是每天均需观察细胞的生长情况，同时还更换新鲜的含有puromycin的新鲜培养基。
最佳浓度的确定，在添加puromycin 3-5d后细胞完全死亡的puromycin浓度即为帅选靶细胞的最佳浓度。
筛选办法2：
逐步筛选，第一天用1μg/ml 筛选，同时查看blank细胞生长情况，直到筛选到能全部杀死blank细胞为最佳浓度。然后以次浓度对细胞进行稳定筛选（特别注意：刚传代的细胞一定不要急急忙忙的筛选，而是稳定培养1-2天后再筛选）
9 慢病毒颗粒感染和选择
9.1 目标细胞准备
同样地需要将研究的细胞进行复苏，扩大培养。在培养的细胞融合率confluent达到70％时，更换新鲜的培养（含有8μg/ml的聚凝胺<ploybrene>，聚凝胺能够增加病毒的感染效果，同时聚凝胺对某些细胞系是有毒，可以用硫酸鱼精蛋白<protamine sulfate>替代聚凝胺）
9.2 慢病毒颗粒感染目标细胞（target cells）
Day1：慢病毒感染细胞
收集好的病毒测量慢病毒的感染复数（multiplicity of infection，MOI），如果具有较高的MOI加入≥0.5ml，较低的MOI加入≤0.1ml（一般慢病毒的加入量是0.05-1ml），37℃ 5％ CO2 潮湿的细胞培养箱中培养过夜。
Day2：更换培养基
在慢病毒感染目标细胞以后，更换为新的培养基。如果观察毒性出现后，需要减少感染的时间至4-20小时。移除病毒包被液，需要在感染至少24小时后方可加入puromycin进行筛选。
Day3+：puromycin筛选细胞
更换含有puromycin培养基筛选细胞若干天后，即可得到阳性克隆细胞。
10 基因敲低（knockdown）验证
10.1 mRNA验证；
10.2 WB验证；
10.3 其它验证。
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最后编辑于 2023-09-11 · 浏览 3.4 万
