EMSA|Electrophoretic Mobility Shift Assay-DNA&Protein 互作证明实验

以前的帖子讲过有激光扫描仪的实验平台做EMSA可以节省很多时间，因为不用进行转膜和抗体孵育等等。对于没有激光扫描仪的实验室，应该按照免疫学方法进行EMSA实验。念书的时候实验室设备比较完善，所以有幸使用激光扫描进行EMSA实验，工作后平台没有设备，于是摸索了免疫学方法。

（上图为念书时做的激光扫描方法得到的最后结果）

用免疫法做EMSA在引物设计时就得开始改变修饰策略，在引物设计时偶联上能与抗体或辣根过氧化物酶体等免疫复合物结合的修饰标签。

如生物素标记，可以在探针合成的时候让公司偶联上去，也可以购买生物素标记试剂盒自己偶联标记。（下图是生工合成修饰添加 页面）

实验步骤：

探针退火、非变性胶的制作、样品反应体系配置，参考我以前帖子顺式作用元件查找，报告载体构建，EMSA探针设计 - 核酸基因技术 - 专业医生社区，医学、药学、生命科学、科研学术交流 (dxy.cn)

• 这里从转膜开始讲：

1. 裁一张与EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5XTBE浸泡10min。
2. 用0.5XTBE浸湿转膜的海绵和滤纸。
3. 把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，避免尼龙膜和滤纸间产生气泡。
4. 小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，轻轻擀平，不要太用力，胶容易扩张，扩张后条带会很丑。（这里需要技巧，因为膜浓度较低，容易烂或者折叠揉在一起）将板从跑胶装置中取出，撬掉薄板，将胶留于厚板上，将板与胶一起盖到滤纸上，用撬板器从右下角轻轻地将膜从厚板上分离，撬板器轻轻亚住膜，另一只手将厚板慢慢往外翘即可。慢慢来，操之过急，容易造成膜变形，最后条带变形或拉伸。
5. 轻轻擀平，再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡。
6. 采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5XTBE为转膜液，把EMSA胶上的探针、蛋白以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。对于大小约为10x8x0.1cm的EMSA胶，用BioRad的常用的Western转膜装置，电转时可以设置为380mA(约100V)转膜30-60分钟。如果胶较厚，则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜液的温度较低，通常可以把电转槽置于4℃冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。具体的电转膜方法请参考电转膜装置的使用说明。
7. 转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上（A4纸），轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤，不可使膜干掉。

• 交联：
• 用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45-60秒，距离膜5-10厘米左右照射3-10分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3-15分钟。最佳的交联时间自行摸索。（注意有溴酚蓝指示带的为跑胶位置指示带，上样组用无色上样缓冲液降低溴酚蓝对最后显影的影响，大概分子量7KDa左右，与指示带平齐，我这个可以作为参考，具体根据自己DNA大小摸索）

• 交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用自封保鲜袋装着放在室温干燥处存放3-5天，然后再进入下一步检测。如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连free probe的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后重复交联一次，以进一步改善交联效果。

• 化学发光法检测生物素标记的探针：

1. 取一合适的容器加入15ml封闭液（2%BSA+0.05%Tween），再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
2. 取7.5μl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用。
3. 去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
4. 将尼龙膜转移至另一装有15-20mlTBST洗涤液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。
5. 重复三次-四次，每次洗涤时间都约为5分钟。
6. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上,进行显示反应。

免疫学方法经过大半年的优化做出了很好的结果，等文章出来再补上。EMSA实验不好做，好的结果需要慢慢摸索，预实验的规律是：先是探针要适当，空探针减少预示结合，不见结合带为不出孔，降低胶和蛋白浓度，降低结合时间。