Wb经验帖‖常见问题汇总（一）干货

以下问题我从提取蛋白到显影去分析，主要是抛砖引玉，如有不对的地方，还请批评指正！谢谢你的观看浏览。

一：信号低（没有条带）

蛋白浓度低（例如动物组织蛋白等提取的浓度低），测一个蛋白浓度先，适当范围加大一点上样/点样的量。

转膜的时候出现正负极错了，导致蛋白没有转上去，如果膜上有marker不考虑，另外用丽春红染色可以看到。

干饭去了，洗膜洗的太久了，洗脱了。

(前面的帖子有讲，所以你注意时间）

一抗二抗用的次数多了，而且你的一二抗兔子和老鼠错了，建议一抗二抗使用不超过8次，做个记录，别用错了！

显影液失效，过期，显不出来。

二：条带背景高（黑糊糊的一片）

转膜贴三明治的时候，你把膜干了，没有注意保湿。

你用牛奶封闭效果不行，前面的帖子讲了牛奶封闭的操作方法，可以去看看。

洗膜洗的不行，注意洗膜的时间问题，如果加长时间有效（可以检查一下tbst的过期了吗？配置问题怎么样？）

一抗的浓度高了，比如1：10000的，你配置成了1：5000，更要命的是还是外国的抗体。

二抗封闭时间久了， 45-1h就够了，后面tbst洗也要注意时间。

三：你的条带有黑点？微笑？粗？

黑点的话，是因为你牛奶没有充分溶解，膜上就有黑点了，像雀斑一样，很可恶。

微笑的形状的话，一个是你配置的转膜液和转膜的时候温度高了，都会导致这样的情况发生。

粗的话，你就是浓缩胶的高度不够，还有很多杂带的话，也考虑是这个原因之一。

四：多带/杂带问题？（一排下来，都有条带）

样品提取的时候，裂解了，你的蛋白酶抑制剂不够，所以提取的时候注意配比，注意条件，至少我有帖子怎么提取蛋白，可以进去看看。

浓缩胶的厚度不够，建议1cm，具体的可以去看看配胶的经验帖。

一抗化学特异性不行，更换一抗，换个外国的，推荐武汉三鹰，三塔也不错。

五：条带有残缺，类似于气泡？（明亮的气泡影）

转膜三明治的时候，用滚筒滚一下，压去气泡，盖三明治的时候，用生物载玻片和盖玻片的方法去操作。

（原来发过帖子，可以去看看）

一二抗抗体孵育不均匀，所以敷抗体的时候要注意深度：浸润的基础上，2-3mm左右。

六：先写这么多，骗你们的赞，可以把你们的问题放在评论区，有空我会一一回复。