Wb经验帖‖page5 封闭的细节 （如果最近经验有反响，我可以写ip/coip、细胞经验帖）

前面发了page1-4，讲述了配胶、点样、电泳、转膜，我都讲的比较经验性，写完整个帖子以后，我会把所有的进行汇总，可以去看看，或许就有收获。

一：关于封闭介绍

1：常用的封闭操作及介绍等介绍

封闭的话，常用脱脂牛奶粉，加tbst溶解，大概5%-10%的浓度。也有实验室专门去买什么封闭液，我觉得没必要，因为tbst也是常用的，牛奶粉雀巢就有卖。所以可以省一下，牛奶效果也不错。（还有啥你们买的洗膜液，还是啥的，几乎可以自己配，技术操作程度都不高）

2：摇床的话，17-18振幅，常温摇个2小时就行，时间长一点也无所谓，这个没太大影响，可以过夜，记得放冰箱，不然明天一早来，牛奶馊了。一股恶臭，但是尽管馊了，不影响实验结果，这个冲击力，算工伤吧！

摇床摇的时候也有讲究，大概这样好一点。如图，选择b，也就是膜的长对摇床的长，膜的宽对摇床的宽（我这个摇床是上下小幅度扇形摇动的）。

3：一张膜分两面，一个是近胶面，一个是背胶面。近胶面转膜的时候是贴着胶的，同理可以知道，背胶面。

放在摇床的时候，近胶侧朝上，背胶侧朝下。因为摇床的时候，下面的可能会被刮到，相对而言。近胶侧的蛋白附着更“牢靠、多机会”，因为这边抓取的嘛！

4：牛奶的配置问题及加多少封闭问题。

前面说了，在电泳的时候就可以配置了，因为临时配，牛奶溶解不充分，显影的会有黑点，好多的那种，下面是我的草图（实图，前面的帖子有，可以去看看）

一般而言，浸润的基础上，再多2-3mm高度的牛奶即可，不要多了，不要多了，不要多了，不要多了！！！！

因为牛奶多了，加上你牛奶封闭时间不够的话，就会封闭效果差，导致最后背景黑差。（想象一下，你一瓶水晃动，和半瓶水晃动，哪个同等条件下，封闭效果好？）

二：封闭的原理

之所以这里我单独挑出来，就是为了后续分析一二抗孵育的时候，你能听懂我的点在哪里。

原理就是：牛奶作为杂蛋白，封闭pvdf/nc膜上，没有蛋白抓取的空隙。

什么意思？上图！

一块膜，像一个网格子，转膜以后，45、44.5、44、43.5kd的分子量会吸附填塞在相应的区域，如图，45、44、43.5都吸附填塞了蛋白，而44.5没有吸附这个区域的蛋白。

那么现在问题来了？这个可以直接不封闭去孵育一二抗体吗？

不行！！！！！因为如果不进行牛奶封闭，在孵育1抗的时候。除了一抗特异性结合他的抗原（也就是目的蛋白，假设我们跑45kd的蛋白），也会物理性的去填塞44.5，为啥嘛？因为44.5kd的时候空的啊！！！！！后面二抗孵育的时候，他可不管44.5kd有没有目的蛋白他只看哪里有一抗，有一抗就会趴过去，最后45和44.5kd区域都有显影/信号，造成比实际的要多一点显影多一点信号，因为原本我只要45的，现在多了44.5kd的，如果36kd 那里也空的呢，那也会36有信号。

所以这个分析，你大概明白了为啥要封闭？为啥洗的时间长了，条带不行了？

对，封闭杂位点！

对，不能把原本的物理性趴在45kd的目的蛋白洗脱了！！！！！

三：封闭的时候，常见的错误点。

1：牛奶溶解不充分，上面讲了。

2：封闭的时候倒多了封闭液，时间又不够。

3：我忘记去封闭了，我直接去一抗二抗孵育了。

怎么办？利用他的原理操作一次呗。

先快速洗，用手晃3次，快去洗去表面的附着的一抗，然后再来3次慢洗，10 10 7 min钟三次，tbst洗，洗的时候同样的tbst不要加多了，不然洗的不充分，时间也不够，效果也不好。做完快洗和慢洗后，就在重新封闭呗。

有人问，那我条带显影的有变化吗，肯定有的，要弱一点了，可以去看看我之前的帖子。

4：还有牛奶不要臭了，放时间长了还用，一个对身体不好，第二个我怕你喝一口带满益生菌细菌的牛奶去威胁老师。我建议当天配，当天用，毕竟雀巢脱脂奶粉很便宜，江浙沪包邮。

目前我想到的只有这么一些！

但是还有最后一点，我看谁看完不点赞不关注不收藏，哼💢，那就祝你做实验有亿点点顺利。哈哈哈，还是希望大家点赞，评论一下，这样丁香园app可以推送给大家！

真实应了那句话：25个英文字母，q被栓住了！

欲知后事如何，请听下回分解