Wb经验贴‖page4“核心人物”电流之转膜篇

还是老规矩，看完记得点赞收藏加关注，这几天码字好累啊！

接着上面的电流篇，这个的话，大家主要看看数据的观测！

一：转膜的常用条件

1：大体上，我看到的实验室都是用的恒压100v，90min跑的转膜。

2：膜的话，有两种，一种是nc膜，一种是pvdf膜，nc膜要甲醇激活（比较危险，有毒呀），pvdf不需要，但是操作之前（三明治之前），需要浸泡，浸泡一下，放托盘里面浸泡，毕竟都有那个转膜液吧！*****最重要的是保湿，不管是结束还是开始，膜都要浸润在转膜液里面，不要干了，不要干了，不要干了（可以看我之前的一个帖子），会影响条带的显影。

3：转膜液和电泳液，一般用个5-6次就换一下吧，如果来不及换的话，那就按我昨天的电流法调电泳电流还有今天的转膜电流（下面会讲）

4：一块胶，贴几块膜？这个可以根据自己的喜好来做！什么意思？我讲几个大家常用的贴膜方法吧！

1）一块胶，贴一张大膜，然后转完膜，去切裁（也可以不裁，看第3小点），这个考验技术，因为你操作不好，会损伤污染膜

2）一块胶，我把提前裁好的膜贴在目标蛋白附近，这个我很推荐，一次贴一张！但是也有一次贴个几张的，我不太推荐！因为合三明治的时候，膜可能会摆动，膜贴不到对应的胶上面！！

3）关于膜与条带的问题

我不管有没有裁膜，膜覆盖的区域都是目标蛋白区域及其附近，会包括附近分子的蛋白。比如我需要45kd，贴个膜，不可能刚刚好只把45转上去，当然60kd、30kd等也可能会转上去，这个毋庸置疑的。

所以如果是贴一张大膜的时候，可以裁，也可以不用裁，什么意思？比如我大膜贴满了整块胶，我膜上有我需要的45、80、30kd的目的蛋白，我就直接第一次用45的抗体操作后面的封闭一抗二抗显影，然后用80的时候，我洗一下就好了（先快速手摆动洗去明显的，然后摇床17-18振幅的10 min 10min 7min钟洗一下，然后再封闭一抗二抗显影就可以得到呢了）

那裁和不裁有什么区别呢？

我说了裁的话考验技术，很容易污染，但是速度快啊，这个快啊！这不好吗？但是像我这样的抠脚大汉，追求极致，我是这样做的：

每一块胶只跑一个目的蛋白，我也不多跑！

4）转膜过程严格控制低温

第一个转膜液保存必须在4℃的冰箱里面，转膜过程中，转膜槽加冰袋，外部也要放在低温环境（放在冰箱里面或者是放在冰桶里面），原因见二中第4点。

5）吃饭问题

民以食为天，吃饭去了，我要去吃饭了，我要去吃饭了，我转膜初始监测没问题和低温控制比较好，那我可以去干饭了，因为胶可以在转膜液下过夜或者是长时间！！！

二：如何监测转膜过程？

老样子还是看电流！！！！！

1:与电泳不同的是：恒压条件下的转膜，它的电流是上升的，对，上升的，有时候会上升到400ma，最后直至电泳仪系统由恒压变成了恒流400ma（我用的电泳仪是这样的），不要慌，看第二条。

2:对于转膜电流的定义，电流大小的话，只在开始时定义大小，一般而言，恒压100v以后，初始电流一般在220～300以内的比较好，如果过大的话，比如＞320了，就算大了，这时候调成320-330恒流吧，不要恒压了，那么如果＜220ma，有啥问题？改吗？算了吧，还是重新配一下转膜液吧，这个没有用！！！为啥这么高或者低？因为转膜液里面有那个甲醇，甲醇容易挥发，所以一般而言，转膜液勤换！

3:转膜的时候电流是增大的，很大的电流，温度会高，所以转膜还是在低温条件比较好（之前电泳的page3讲了这个）

4:怎么判断你的过程有问题了？

就是说你的温度/电流过大。转膜结束后，你去拆开的时候，你会发现用手拆三明治模型比较烫手，说明温度/电流大了，一般而言，做到这里，我摸到这个温度，我就能大概猜到结果了，如果烫手一般而言，条带呈现笑脸😃性状，最后显影的效果是wb背景比较赃，啥情况？因为你的温度过高，会使得膜对于后续显影液的物理蓄积/残留/积留，会造成都有背景，就是信号高，所以脏！