蛋白凝胶电泳和WB常见问题和解决方案

蛋白凝胶电泳

1.蛋白条带无法分辨,泳道带有条纹且不直

可能原因

每条泳道上样的蛋白过多

解决方案

降低样品上样量。在带有10、12、15或17孔的小型胶中,获得理想分辨率的最大建议上样量是每条带0.5 ug ,或每条泳道约10—15 ug 细胞裂解液。

2.样品粘稠,在样品泳道边缘有条纹,哑铃型条带,泳道变宽

可能原因

凝胶电泳过程中,样品的盐浓度(硫酸铵)过高

解决方案

通过透析来降低盐浓度，在电泳前浓缩并用低盐缓冲液进行重悬，使用小体积浓缩管，确保盐浓度不超过100 mM 。

3.蛋白聚集导致了无法识别的狭窄泳道

可能原因 

DNA 污染—细胞裂解液中的基因组 DNA 可能会使样品变得粘稠,导致蛋白聚集,从而影响蛋白的迁移模式和分辨率

解决方案

在上样前剪切基因组 DNA 以降低样品的粘稠度。

4.样品泳道不均一,泳道变宽

可能原因&解决方案

一.凝胶电泳过程中样品盐浓度(氯化钠)过高。高盐浓度会导致电导率提高而影响蛋白的迁移,并使得蛋白条带延伸至相邻含有正常盐浓度样品的泳道中；

1. 通过透析来降低盐浓度；
2. 在电泳前进行浓缩并用低盐缓冲液进行重悬，使用小体积浓缩管；
3. 确保盐浓度不超过100 mM ；

二.凝胶电泳中去垢剂(如SDS 或 Triton X -100去垢 Tween 20去垢剂)浓度过高。去垢剂与凝胶中的阴离子去垢剂SDS 可形成混合胶束,并向下迁移到凝胶中；它们会干扰 SDS —蛋白结合的平衡；

1. 绝大多数非离子型去垢剂如 Triton X-100、NP-40和 SDS 或 Triton X-100去垢 Tween 20去垢剂)都会对 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE )产生干扰；
2. 保持 SDS 和非离子型去垢剂的比例在10:1或更高以将这些影响降至最低；
3. 使用去垢剂去除柱来去除多余的去垢剂；

三.高浓度的 RIPA 裂解液可导致电泳时泳道变宽并产生明显的条纹；

1. 在电泳前将样品稀释以降低裂解缓冲液的终浓度,防止缓冲液相关问题发生。

5.泳道边缘有阴影

可能原因

裂解液或样品缓冲液中存在过量的还原剂

解决方案

用于 SDS-PAGE 的还原剂中, DTT (二硫苏糖醇)和CEP (三(2-羧乙基)膦)的终浓度应低于50 mM ,而βME ( β-—巯基乙醇)的浓度应低于2.5%。

化学发光免疫印迹

1.非特异性或弥散的条带

可能原因 解决方案

抗体浓度过高 降低抗体的浓度,尤其是一抗

上样至凝胶蛋白过多 降低凝胶中的蛋白上样量

来自化学发光底物信号过强 降低印迹膜曝光于胶片的时间

缩短膜与底物孵育的时间

在孵育后完全去除底物

降低抗体的浓度,尤其是 HRP 和 AP 标记抗体

2.仅部分区域显影或存在空白区域

可能原因

转膜不完全

解决方案

1. 通过在整个转膜三明治范围内使用气泡滚轮，来确保在转膜过程中凝胶和膜之间充分接触；
2. 按照制造商的说明书进行膜的浸润和激活；
3. 处理膜时始终佩戴洁净的手套或使用镊子。

3.高背景

可能原因&解决方案

一.抗体浓度过高

1. 降低一抗或二抗的浓度

二.封闭液不适用

1. 在亲和素-生物素体系中不要使用牛奶进行封闭，因为牛奶中含有生物素,可导致高背景；
2. 当检测磷酸化蛋白时,应避免使用基于磷酸盐的缓冲液一如 PBS ,以及含有磷蛋白的封闭剂—如牛奶或酪蛋白,推荐使用溶于 Tris 缓冲液溶液中的 BSA ；
3. 通过封闭一张洁净的膜、用抗体孵育并随后用相应底物进行检测,来测试封闭液的交叉反应性；
4. 当使用碱性磷酸酶( AP )偶联物时,应选择溶于 Tris 缓冲液( TBS )的封闭液,因为磷酸盐缓冲液( PBS )会干扰 AP 的活性；
5. 尝试另外一种与实验最具兼容性的封闭液。

三.非特异性位点封闭不充分

1. 提高封闭液中的蛋白浓度；
2. 优化封闭的时间和或温度。室温封闭至少1小时,或4C过夜；
3. 向封闭液中加入 Tween 20去垢剂可帮助将背景降至最低。然而,过多的去垢剂会干扰抗体结合。0.05%的终浓度通常就能顺利发挥作用；
4. 使用含0.05% Tween 20去垢剂的封闭液制备抗体稀释液；
5.  使用"信号增强剂来降低背景,并增强低丰度蛋白和弱免疫反应性抗原的检测。

四.漂洗不充分

1. 提高漂洗次数或所使用缓冲液的体积；
2. 向漂洗液中加入 Tween 20去垢剂全终浓度0.05%。如果 Tween 20去垢剂的浓度过高,则会导致蛋白从膜上被剥离；

五.膜的处理不当

1. 按照制造商说明书进行膜的浸润和活化；
2. 处理膜时始终佩戴洁净的手套或使用镊子；
3. 始终用液体覆盖膜以防止干燥；
4. 在所有孵育过程中进行振荡；
5. 小心处理膜—膜的损伤会引起非特异性结合。

六.设备或材料污染

1. 使用前新鲜制备缓冲液,并对其进行过滤；
2. 仅使用洁净且不含污染物的电泳设备、印迹设备和孵育托盘。

七.来自化学发光底物的信号过强

1. 降低印迹膜曝光于胶片的时间；
2. 缩短膜与底物孵育的时间；
3. 在孵育后完全去除底物;
4. 降低抗体的浓度,尤其是 HRP 和 AP 标记抗体。

4.信号较弱或无信号

可能原因&解决方案

一.转膜不完全或效率不高

1. 转膜后,对凝胶进行染色以评估转膜的效率；
2. 在转膜后,通过用 可逆转蛋白染色试剂盒对膜进行染色以评估转膜的效率；
3. 通过在整个转膜三明治范围内使用气泡滚轮,来确保在转膜过程中凝胶和膜之间充分接触；
4. 确保转膜三明治在转膜装置中的摆放方向正确,以便蛋白迁移至膜上
5. 按照制造商说明书对膜进行浸润和激活
6. 使用阳性对照(如预染分子量标准)评估转膜的效率；
7. 使用与免疫印迹成像底物兼容的分子量标准免疫印迹蛋白标准品,作为阳性对照；
8. 提高转膜的时间或电压；
9. 确保样品制备条件不会破坏样品的抗原性。例如,某些蛋白不能在还原性条件下电泳。

二.与膜的结合不充分

1. 对于低分子量( MW )抗原,向转膜缓冲液中加入20%甲醇以促进结合并防止蛋白穿透膜；
2. 减少转膜时间，低分子量抗原可能会穿透膜；
3. 对于高分子量抗原,向转膜缓冲液中加入0.01-0.05% SDS 以将蛋白从凝胶拉出至膜上；
4. 更换膜的类型( NC vs . PVDF )；
5. 换成更小孔径的膜。

三.抗体浓度过低

1. 抗体与目标蛋白的亲和性可能较低。提高抗体浓度；
2. 抗体可能已经失去活性,可通过斑点印迹以检测效价。

四.抗原不足

• 上样更多蛋白样品至凝胶上。

五.抗原被封闭液掩盖

1. 降低封闭液中蛋白的浓度；
2. 查找与您的实验最具兼容性的封闭液。

六.缓冲液含有叠氮化钠

• 叠氮化钠会抑制 HRP 。请勿将其与 HRP 标记抗体一起使用。

七.来自化学发光底物的信号太弱

1. 提高膜与底物孵育的时间；
2. 提高胶片曝光的时间；
3. 确保底物未过期或失效；
4. 当蛋白样品量极少或样品高度稀释时，可使用极敏底物来获得更强的免疫印迹信号。

八.已剥离了印迹上的抗体并重新检测

1. 避免在同一张膜上多次剥离抗体；
2. 缩短在抗体剥离液中的孵育时间以防止抗原的损失。

九.膜上的抗原被消化

• 封闭底物可能具有蛋白酶活性(如明胶)。

十.印迹膜长时间保存,其上的蛋白降解

• 制备新的印迹膜。

看了赛默飞的蛋白免疫印迹优化指南感觉挺有用的，就发出来，让新手学习一下，后面还有免疫荧光可能遇到的一些问题，这个就弄了半天，休息休息