【经验分享】蛋白表达纯化

本人个人经历，做了了许多原核蛋白表达载体构建、蛋白表达纯化及结晶的工作，也涉及到慢病毒稳转细胞系构建，还有流式相关试剂的研发。蛋白的表达量在毫克级别。在整个实验过程也遇到了许多问题，同时也解决了一些问题，在这拿出来分享讨论，人多力量大，尽量少走弯路。我会挑选一些我个人觉得比较重要或者遇到过难题的实验步骤进行分享。如果有不详尽的地方，欢迎留言讨论，知无不言言无不尽。

蛋白表达纯化我会放在这个板块分享。表达载体构建放在【核酸基因技术-载体构建】板块。链接：https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/45647897?fpap=1

关键词：原核细胞 可溶性蛋白 表达纯化

一、蛋白表达

1、表达感受态细胞的选择：一般使用BL21(DE3)就可以了，如果是遇到一些外源基因尤其是真核基因不好表达，可以尝试使用Rosetta(DE3)，如果遇到一些毒性蛋白，可以使用pLysS系列的感受态细胞。其他的我没用过，所以就不说了。

2、蛋白表达方法：我最终的培养量是1L，所以培养过程中分了几个步骤。首先取50 μL转化后的感受态细胞悬液接种至10 mL含抗生素的LB培养基中做为起始培养在210 rpm、37 ℃恒温摇床中培养过夜；再将过夜培养的10 ml菌液接种至1L含有抗生素的 LB培养基中（接种量为1:100）进行扩大培养，210 rpm、37 ℃培养至OD600=0.8左右（约4-5 h）；OD600达到0.8左右时，降温至16 ℃培养，当菌液温度达到16 ℃时，加入0.5 mM过滤除菌的IPTG诱导蛋白表达16-20 h。

3、蛋白表达条件：我个人觉得，如果蛋白不表达，或者表达量低，或者是包涵体的话，调整表达条件不是最好的选择。我曾经有一个蛋白，表达量很低，而且很大一部分是在包涵体中，于是我花了1个月的时间，摸索表达条件，IPTG浓度，诱导时间，诱导温度，培养转速，甚至菌液诱导时的浓度也做过摸索，的确是不同条件下，表达情况不同，但是对我的要求来说，影响确实不大，都不能满足我的要求，所以自此以后再也没做过表达条件的优化，一直都是37 ℃培养，16 ℃诱导。

至于后来是怎么解决的呢，首先更换了载体，以前用的是pET系列的，例如28a和32a，后来就就改成pRSF-Duet-1，尝试表达，发现蛋白表达量很高很高，但是大部分都是包涵体。于是我又通过生物信息学分析，在不影响蛋白功能的前提现，对蛋白进行了截短，截短后的蛋白同样使用pRSF-Duet-1载体，进行表达之后发现，成了，大部分都是在上清中，而且量非常大，1 L菌液通过亲和层析、离子交换层析和分子筛层析等3次纯化后，大概能得到10~20 mg的蛋白。

二、蛋白纯化

1、纯化步骤：为了得到高纯度的蛋白，一般都会进行3次纯化，使用重力柱做亲和层析，使用蛋白纯化系统做离子交换和分子筛。

2、首次纯化SDS-PAGE样品的选取：

a、蛋白在首次纯化时，为了详细了解蛋白的各种表达和纯化情况，要在各个环节进行取样进行SDS-PAGE。由于我的菌量比较大，因此使用的是高压连续细胞破碎仪，对于菌量很少的，可以用超声，不建议用化学的方法进行裂解。

b、蛋白表达情况判断的样品制备：取50 μl细胞裂解液于EP管中，12000 rpm、4 ℃离心10 min，取上清加入50 μl 8 M尿素混匀，再取100 μl 8 M尿素溶解沉淀，然后分别各取40 μl与10μl 5×蛋白上样缓冲液混匀，置于96 ℃金属浴上闭盖加热5 min，制成沉淀和上清样品，用于SDS-PAGE，上清和沉淀样品可以判断蛋白是否表达，表达量如何以及溶解性。

c、亲和层析（以镍柱为例）样品制备：蛋白裂解离心后的上清用于后续的纯化，先用Lysis Buffer对镍柱进行清洗，将之前破碎离心后得到的上清液缓慢倒入层析柱中，收集流穿液，待上清液完全流出后，将流穿液再缓慢倒入层析柱中，重复三次，以提高蛋白的结合量；用lysis buffer清洗层析柱，直至用蛋白检测液（含有考马斯亮蓝G250，有蛋白时会变成蓝色）检测流穿液颜色不再变蓝（50 μL蛋白检测液工作液与20 μL流穿液混合，观察颜色变化）。然后堵住底部出液口，加入3 mL lysis buffer吹打混匀，取40 μL与10 μL 5×蛋白上样缓冲液混匀，置于96 ℃金属浴上闭盖加热5 min，制成挂柱后介质样品，用于SDS-PAGE，观察蛋白挂柱情况；再用elution buffer 清洗层析柱，直至用蛋白检测液检测流穿液颜色不再变蓝，收集蛋白洗脱液。然后堵住底部出液口，加入3 ml elution buffer吹打混匀，取40 μl与10 μl 5×蛋白上样缓冲液混匀，置于96 ℃金属浴上闭盖加热5 min，制成洗后脱介质样品，用于SDS-PAGE，观察目的蛋白在填料上的残留情况；将以上制得的所有样品进行SDS-PAGE，鉴定蛋白此步骤纯化情况。

d、通过观察电泳条带，判断蛋白是否可溶性表达，蛋白表达量如何，在哪个咪唑浓度下可以将杂蛋白洗下的同时又不会洗下大量目的蛋白，是否会有部分蛋白黏在填料上无法洗脱。找到一个合适的咪唑浓度，再次纯化时即可使用此咪唑浓度直接做为lysis buffer进行挂柱洗杂，无需每次都进行梯度洗脱实验。

3、蛋白纯化系统纯化：后续使用蛋白纯化系统纯化，不是必须的，也不是都会用到，所以不在这里进行叙述，有用到的可以留言讨论。

三、蛋白结晶

如果有朋友做这一块，也可以一起讨论讨论。