小分子蛋白WB经验贴

跑一个20KDa的蛋白和35KDa的蛋白，4%-12%预制胶，80v跑浓缩胶，120v跑分离胶（第一次是180v跑到底），切胶，分别用0.45微米的和0.22微米的PVDF膜湿转，200mA，20KDa的蛋白转了1个小时，35KDa的蛋白转2个小时，转完后marker都很清晰，用新制的5%脱脂奶粉封闭2个小时后洗涤，分别敷一抗，4度冰箱过夜，洗涤后敷二抗室温1小时，洗涤后曝光，35KDa的蛋白条带清晰且背景干净，但是20KDa的蛋白不仅没有条带而且背景很脏。20KDa的蛋白跑两次了，第一次是恒压72v跑50min,第二次恒流（加大电流）延长10分钟跑，也没出来。请大佬给个建议，谢谢！