Wb经验贴‖“核心人物”电流之电泳篇

爱说不说,看完不点赞就很过分,我分享是干货,不分享都看得的到的,还不给我点赞或者关注!!!那就过分了!!!!!
一:关于电流的认知
很多人把western blot看成了玄学,我觉得大多数人没有用学会去总结,总是按着原来师兄师姐的步骤来,所以把wb想着很难很难,其实你仔细想想为啥wb难?其他实验简单,你总是机械化的去关注一个指标!
什么意思?
比如我师兄师姐的笔记本上写的就是说恒压,所以压压,我要恒压呀,我要的就是恒压呀!
那你就会有时候时而灵,时而不灵了,那就很可恶!
这时候我要讲的“电流”就出场了!
1:下图是电泳仪,牌子啥的没有区别,可能就是功能多了一两个而已,不管啥牌子的,只要能控制恒压恒流时间的电泳仪都是好的电泳仪

2:关于电流的认知。
1):电流的大小
会影响了体系的温度,就是说温度与电流大小成正比,那电压呢?也能,但是不直观。
2):电流大小能反应体系的条件,什么意思?因为你给了恒压,在胶上跑得电流是会变化的,更符合实际情况的,为什么?因为电压/电阻=电流,你设置了电压高枕无忧,电流是在变化啊,你不知道他跑得什么样了啊,你知道吗?不知道!为什么电流会变化?因为电泳液里面有甲醇啊,黑化肥挥发会发灰啊!!!!哈哈哈哈,所以为啥让你看电流你知道了吧!
所以我选择将电流作为金标准!
二:怎么运用到电泳之中呢?
一般实验室的操作,无非就是先80v电压等marker分开再来120v电泳,然后就等电泳结束。你别抬杠,你说……,其实就是换汤不换药,都一样的,改了改时间电流电压啥的呗。上面诸如此类,都是你的师兄师姐教的,他们的实验记录本也是这样写的,所以你操作的时候,你也会觉得没毛病,其实大错特错。
那你喜欢这样不动脑子的,我就给你总结了一套理论,不好看,你来找我!
1、使用电流观测法的原则
恒压和横流是切换的,电流是里面的评价标准。首选恒压,如果恒压时,电流不行,就选横流(具体看下面2)
2、电流观测法的具体操作细节
1:电泳过程,恒压的时候,电流在降低,降低比较缓慢,这是正常的!
(如果快速掉电流,甚至到了个位数,说明你的电泳槽的板没有形成密闭体系,你的电泳液从那个漏到了电泳槽里面,赶紧停了,重新组装胶板)
2:开始跑电泳,我设定恒压80v进行跑,我这时候立马观察这时候的电流,这个电流多大,如果说>55ma,或者<30ma,我讲他定义为过大或者过小,啥问题呢?为啥这么大,亲,你该换换电泳液了,别在用了,次数多了,亲,你说你的课题组穷,好吧,我也穷,怎么办?
这时候,不要用恒压了,用恒流45-55跑都可以,我一般喜欢用45恒流跑,直到我结束电泳操作,有人问这样不会有问题吗?我用我n多次成功告诉你,没问题,尽管来!
3:我跑80v恒压跑,电流一直降,marker没分开呢,电流就下降到过小了(此时<22ma了),我该怎么办?
这时我直接调到120v,再看电流大小,如果还是小了的话,重复2的操作即可
4:我Marker分开了,现在加压到120v恒压跑电泳,如果电流合适,就接着跑,直到结束,如果不合适,按2操作即可。
三:除了这个电流核武器,我还需要注意哪些东西呢?
1:什么叫分开了?

这样的红红绿绿都有了,就可以算是分开了啊!就可以加120v了啊!加压后。同时需要看电流大小。
2:什么时候停?
这就看你需要什么kd的目的蛋白了?比如我要220kd的,我跑到,220kd有颜色marker明显的时候就停掉。就可以,没必要跑成下图。

那我要是跑啥15kd呢?那就必须跑的时间久点了。大致跑到胶的底上5mm到1cm左右。如下图

那我要是跑的时间久了呢?兄弟,你为啥要这样,肯定跑脱了啊!所以注意火候!!!!!!
3:除了电泳,我还需要干嘛?
这时候可以配置牛奶了,新鲜的脱脂牛奶,5%-10%都可以,tbst溶解。雀巢就有卖哦!!!哈哈哈这感觉像是一波广告!哈哈哈哈,笑死我了。
为啥现在配?因为你现在不配,我怕你牛奶等你要用的时候,我怕你溶解不充分,会导致条带有个黑点,这个在我之前的帖子有讲,去看看吧!哈哈哈!
4:我跑电泳的时候,我可以溜去干饭吗?
相对可以,不是绝对的可以,哈哈哈,民以食为天嘛!主要是看你跑得快结束了吗?
如果我还在80v恒压下跑或者是横流下跑(还没结束)的时候,那我干饭去。哈哈哈!80v恒压干饭可以时间长一点,横流就不行了,原因前面有讲,因为电流特点。
那我电泳跑完了,我现在不想转膜,我去干饭可以吗?
你它喵的可真是个干饭人,可以吗?可以,但是你去买个饭时间是可以的,不要超过30min啦,尽快去转膜啦!
5:就是你看完这么多,还不点赞收藏加关注,耍流氓啊!!!!哼💢