kidney injury by suppressing the NF-κB

利胆排毒片通过抑制NF-κB信号通路减轻脂多糖诱导的急性Kidney损伤

摘要

据报道，由中国传统制剂组成的医院制剂Lidanpaidu Prescription（LDP）具有抗内毒素，抗凝血等作用。然而，其对脂多糖（LPS）诱导的急性Kidney损伤（AKI）的治疗作用及其机制仍不清楚。因此，我们对LPD进行了不同剂量的预处理，以研究LPS诱导的AKI对小鼠的保护作用和机制。通过组织学检查评估LPS诱导的Kidney脏损伤。 ELISA用于检测炎性细胞因子的水平。通过RT-PCR评估Kidney组织中炎性基因IKKβ和TNF-α的mRNA表达。最后，通过蛋白质印迹法评估了NF-κB信号通路相关蛋白，并通过免疫荧光共聚焦显微镜检测了NF-κBP65的核转运。研究结果表明，通过Kaplan-Meier分析确定，与LPS组（26.7％）相比，LDP在48 h动物存活率（66.7％）上有明显改善。 LDP减弱了LPS诱导的Kidney脏组织病理学改变，并降低了血清和Kidney脏组织中的炎症细胞因子水平。此外，LDP显着抑制炎症基因的表达并抑制细胞核中相关蛋白的活化。总之，这些发现表明，LDP通过与NF-κB信号通路抑制相关的机制降低LPS诱导的AKI。

Keywords: Lidanpaidu prescription Acute kidney injury Inflammation NF-κB signaling pathway

1.引言

败血症是一种系统性的炎症反应综合征，具有复杂的发病机制，主要由侵袭性感染引起[1]。败血症诱导的死亡的主要原因是不受控制的免疫反应，导致组织和器官损伤[2,3]。内毒素引起的败血症中最易受攻击的靶器官之一是Kidney脏。 ICU中超过50％的患者患有急性Kidney损伤（AKI）[4]，死亡率高达30％60％[5,6]。有许多治疗脓毒症及其并发症的治疗方法，例如急性Kidney损伤[7]，但其死亡率没有显着降低。

脂多糖（LPS）位于革兰氏阴性菌的外膜中。在小鼠和其他动物模型中，LPS会诱导AKI，并通过核因子-κB（NF-κB）激活导致强烈的炎症反应[8]。当发生AKI时，内毒素会诱导细胞因子的产生，导致全身性细胞因子风暴，并伴随NF-κB信号通路的激活。 NF-κB是内毒素信号转导通路下游的重要转录因子。当发生炎症时，I kappa B激酶beta（IKK beta）首先被激活，然后激活的抑制剂kappa B（IκB）激酶降解NF-κB抑制蛋白IκB并允许NF-κB转移到细胞核中[9,10] 。因此，抑制NF-κB信号传导途径可能阻止AKI。

根据中医辨证论治，利胆排毒片（LDP）由茵陈、栀子、丹参和其他六种中药（TCM）组成，并与茵陈蒿汤和大成七汤合用。茵陈蒿汤和大成气汤是汉代张仲景在《温病论》中的著名方剂。研究和临床应用表明，茵陈蒿汤和大成气汤均具有良好的胆碱和抗炎作用[11,12]。 LDP的抗内毒素作用也已通过体内和体外实验证明[13-15]。 LDP还获得了国家专利（专利申请号CN200710051818.6，专利公开号CN100589820C）。在临床上，它主要用于治疗由内毒素血症引起的感染，创伤和功能性病变[13 16]，并且对呼吸道感染和泌尿系统感染，尤其是Kidney炎具有良好的疗效。但是，其作用机理尚不清楚。在本研究中，我们调查了LPS引起的小鼠LDP对AKI的保护作用和作用机理。

2 材料和方法

2.1化学试剂

脂多糖（LPS； 0111：B4）购自Sigma Chemical Co.（美国密苏里州圣路易斯）。 FastQuant RT套件和SuperReal PreMix Plus套件购自Tiangen Biotech Co.Ltd（中国北京）。核和细胞质蛋白提取试剂盒，BCA试剂盒和BeyoECL Plus试剂盒由Beyotime Co. Ltd.（上海）供给。 TNF-α，IL-6，IL-10 ELISA试剂盒购自Bioswamp（武汉，中国）。

2.2 LDP的制备

十堰市太和医院供给的利胆排毒片是根据Zheng等人描述的制备方法制备的[16]。根据中国药典（2015年版），湖北中医药大学的陈克力教授证明制剂中的所有草药（表1）均不含内毒素。提取物的成分分析已由其他作者供给[16-18]。

表1 利胆排毒片组成

2.3动物和治疗

总共从湖北实验动物研究中心（武汉，中国）购买了108只小鼠（BABL / c小鼠，6 8周龄）。所有程序均经湖北中医药大学伦理委员会批准。在第一组研究中，将60只BALB / c小鼠随机分为四组：对照组（盐水），LPS组（LPS 7 mg / kg），LPS + LDP（LDP 75 g / kg + LPS 7 mg / kg） ）组，LPS +地塞米松盐酸盐[19]（5 mg / kg + LPS 7 mg / kg）组。通过胃内给药对所有小鼠给药7天。在最后一次胃内给药后1小时，腹膜内注射LPS组，LPS + LDP组和地塞米松组LPS（7mg / kg），对照组注射等量的生理盐水。然后，每4小时至48小时监测小鼠的一般状况和存活，并绘制存活曲线。在第二轮研究中，将48只小鼠随机分为六组（每组n = 8）：对照组，LPS组（LPS 7 mg / kg），LPS + LDP（37.5、75和150 g / kg + LPS 7 mg / kg）组和LPS +地塞米松盐酸盐（5 mg / kg + LPS 7 mg / kg）组。施用方法如上所述。 LPS注射后六小时，将小鼠剔除，并收集血液和Kidney脏组织。

2.4炎性细胞因子的测定

收集眼眶后血样，然后在4℃下以2500 rpm离心20分钟以收集血清。在冷PBS中将Kidney组织研磨以获得匀浆。根据制造商的方案，使用ELISA试剂盒（Bioswamp）测量血清和Kidney脏匀浆中的TNF-α，IL-6和IL-10。

2.5组织病理学检查

将Kidney脏组织固定在10％甲醛中，包埋在石蜡中，然后切成5μm厚的切片，然后用苏木精和曙红（H＆E）染色。在光学显微镜下观察组织学变化。

2.6 RT-PCR分析

从Kidney脏匀浆中提取总mRNA，并通过超微紫外检测器测定RNA的纯度和浓度。通过FastQuant RT试剂盒（Tiangen Biotech）将mRNA反转录为第一链cDNA。然后根据制造商的说明，使用第一链cDNA和SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）试剂盒（Tiangen Biotech）进行半定量实时PCR。使用Roche L480实时PCR系统，以20μL反应体积进行35个循环的实时qPCR。上游和下游引物序列如先前[20]所述：对于β-肌动蛋白：正义引物：5'-TTGT TACCAACTGGGACG-3'，反义引物：5'-GGCATAGAGGTCTTTA CGG-3'；对于IKKβ：正义引物：5'-AGGGCGACAGGTGAACAGAT -3'，反义引物：5'-CTAAGAGCCGATGCGATG -3'；对于TNF-α：正义引物：5'-GGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTGC-3'，反义引物：5'-ACATTCGAGGCTCCAGTGAATTCGG-3'。 IKKβ的循环从95℃开始15分钟，然后循环35次：在95℃变性20 s，在56℃退火30 s，在72℃延伸40 s。 TNF-α的循环在95℃下开始15分钟，然后循环35次：在95℃下变性20 s，在60℃下退火30 s，在72℃下延伸40 s。通过2-ΔΔCT计算方法测量基因表达。

2.7蛋白质印迹分析

在冰上从Kidney脏组织匀浆中分离出总蛋白，细胞质蛋白和核蛋白。使用BCA试剂盒（Beyotime）测量提取的蛋白质的浓度。蛋白质样品通过12％SDS-PAGE分离，然后转移至PVDF膜（Millipore）。用5％脱脂牛奶封闭后，将PVDF膜与抗p-NF-κB（1：1000; CST;目录号：3033T），Lamin B1（1：1000; CST; 12586S），IκB（ 1：1000; CST; 4812S），p-IκB（1：1000; CST; 9245S）和β-肌动蛋白（1：1000; CST; 4970S）在4 C下过夜。在室温下将膜与适当的二抗一起孵育后在1小时的温度下，使用BeyoECL Plus试剂盒（Beyotime）标记免疫反应条。使用凝胶成像系统（Bio-Rad）获得印迹。

2.8免疫荧光

为了观察NF-κBp65蛋白在不同组中的核易位，我们根据文献中描述的方法进行了免疫荧光共聚焦激光扫描实验[21]。简而言之，将Kidney脏固定在福尔马林中并包埋在石蜡中。然后将切片与0.3％Triton X-100和10％BSA孵育。 NF-κB抗体（1：200； CST；目录号：8242S）被用来标记蛋白质，细胞核用DAPI染色。最后，使用共聚焦激光扫描显微镜（Nikon C2）获得图像。

2.9统计分析

所有结果均表示为平均SEM。使用SPSS Statistics 22.0统计软件进行分析。通过单向方差分析分析各组之间的均值比较。使用Kaplan-Meier曲线评估生存率，并进行logrank检验以分析数据。 P <0.05或P <0.01表示具有统计学意义。

3.结果

3.1 LDP对致命性败血症小鼠存活的保护作用

LPS组小鼠在12 h时开始死亡，其48 h最低（26.7％）存活率。 LPS + LDP组的首只死亡小鼠在12h时存活率为66.7％，而LPS +地塞米松组的首例死亡在24h时存活率为80.0％。对照组未发生死亡。 LPS组与对照组之间的差异（χ= 17.414，P = 0.000），LPS + LDP组与LPS组之间的差异（χ= 8.310，P = 0.004），以及LPS +地塞米松组与LPS组之间的差异（χ= 8.310，P = 0.004） χ= 11.649，P = 0.001）是显着的。（图1）

图1 成活率分析。 与对照组相比，P <0.01； **与LPS组相比，P <0.01。

3.2 LDP对炎性细胞因子表达的抑制作用

如图2所示，LPS组的炎症细胞因子表达显着增加。这些水平被LDP（37.5，75，150 g / kg）和盐酸地塞米松（5）以剂量依赖性方式显着抑制。毫克/公斤）。治疗组与对照组之间无显着差异。

图2 血清和Kidney脏组织中炎性细胞因子的表达。 n ＝ 8，平均值±SEM。 与对照组相比，P <0.01； * P <0.05 vs. LPS组； **与LPS组相比，P <0.01。

3.3 LDP对病理变化的抑制作用

如图3所示，对照组的Kidney脏组织形态正常。但是，LPS组的Kidney脏组织明显受损，包括扁平和脱落的Kidney小管上皮细胞，刷缘缺失和可见的裸膜。在LDP（37.5，75，150 g / kg）和地塞米松（5 mg / kg）组中，这些Kidney脏组织损伤得到明显改善。

图3 Kidney脏组织的HE染色。 （苏木精和曙红染色，A：放大倍数200； B：放大倍数400）。

3.4 LDP对TNF-α和IKKβmRNA的抑制作用

LPS组中TNF-α和IKKβmRNA的表达明显升高。在LDP（37.5、75、150 g / kg）和地塞米松（5 mg / kg）组中，mRNA表达显着下降。 LPS可以显着上调炎性基因的表达，而LDP给药可以剂量依赖性方式降低这些基因的表达（图4）。

图4 LDP对Kidney脏组织mRNA表达的影响。 n ＝ 8，平均值±SEM。 与对照组相比，P <0.01； * P <0.05 vs. LPS组； **与LPS组相比，P <0.01。

3.5 LDP对NF-κB信号通路相关蛋白的影响

通过蛋白质印迹分析评估了NF-κB信号通路相关蛋白。数据显示，LPS组中IκBα的磷酸化率最高。 LDP和地塞米松预处理可降低IκBα磷酸化率。此外，LPS组的核蛋白和细胞质蛋白中磷酸化的NF-κBp65均显着上调，而预处理组则显着下调（图5）。

图5 NF-κB信号通路相关蛋白的表达。 n ＝ 3，x±s。 与对照组相比，P <0.01； * P <0.05 vs. LPS组； **与LPS组相比，P <0.01。

免疫荧光共聚焦显微镜观察，对照组p65表达低，主要存在于细胞质中。 LPS组中p65的表达最高，主要存在于细胞核中。预处理组的核p65水平明显低于LPS组。图像表明激活的细胞位于Kidney小管和Kidney皮质中（图6）。

图6 LDP对NF-kB和p65在细胞核中的表达和转运的影响。 A：对照组； B：LPS组； C：LPS + LDP（37.5g / kg + LPS 7mg / kg）组； D：LPS + LDP（75g / kg + LPS 7mg / kg）组； E：LPS + LDP（150g / kg + LPS 7mg / kg）组； F：LPS +盐酸地塞米松（5mg / kg + LPS 7mg / kg）组。 （放大倍数400）。

4 讨论

重症监护病房中47.5％的败血症引起急性Kidney损伤[22]。由败血症引起的AKI的死亡率也显着高于非败血症急性Kidney损伤的死亡率。目前，尚无对脓毒症AKI的有效治疗方法。内毒素可导致动物多器官功能障碍，例如heart，肺，肝，Kidney和其他器官。在LPS诱导的模型中，LPS的作用是时间依赖性的。在动物中，LPS破坏的第一个器官是肺，其次是其他器官。腹膜内注射LPS后6 hKidney损害达到峰值[23]。当被LPS刺激时，NF-κB信号通路被激活[24]。在这项研究中，我们使用LPS诱导的小鼠AKI作为模型来研究LDP的保护作用及其可能的保护机制。结果表明，LDP可以通过抑制NF-κB信号通路的相关机制减轻LPS引起的败血症AKI的损害。

根据生存测试，与LPS组相比，LDP和地塞米松组似乎可以保护免受致命性内毒素血症的影响（生存率为26.7％）。 LPS刺激可以激活巨噬细胞并诱导炎性细胞因子的分泌[25]。 ELISA结果表明，LPS刺激后，血清和Kidney脏组织中促炎细胞因子TNF-α和IL-6明显升高。 TNF-α和IL-6是炎性疾病发病机理中的关键促炎细胞因子。 TNF-α和IL-6的显着降低表明LDP治疗对LPS诱导的AKI具有抗炎作用。先前的研究[8,26]表明，抑制炎症细胞因子的产生可以有效治疗LPS诱导的AKI。同时，抗炎因子IL-10的上调表明，在LPS给药后，人体正试图调节炎症。 LDP治疗后IL-10水平的降低表明其在AKI的治疗中预后良好。另外，组织学分析还表明，LDP减轻了Kidney损伤。

NF-κB是与各种炎性疾病的发病机制相关的重要转录因子[20]。许多细胞外刺激，例如LPS，TNF-α和IL-6，都可以激活NF-kB信号通路。当被刺激时，IKKβ亚基被磷酸化并被激活，从而使IkBα蛋白的Ser32和Ser36位点被磷酸化。随后，IκB蛋白被泛素化并被26S蛋白水解酶降解。最后，p50 / p65被释放并转运到细胞核中以特异性结合靶序列并调节基因表达[27]。为了确定LDP的保护机制，我们检查了LDP对NF-κB信号通路激活的影响。结果表明，LPS给药后Kidney脏组织中的IKKβmRNA，NF-κBmRNA，IκB和磷酸化IκB蛋白升高。同时，我们还检测了细胞核和细胞质中磷酸化的NF-κB蛋白的含量，表明信号通路被激活。 Western印迹分析发现，在LPS组中，NF-κB在细胞核和细胞质中显着增加，表明磷酸化的NF-κB蛋白进入细胞核并激活了信号通路[28,29]。用LDP和地塞米松处理后，NF-κB途径相关基因和蛋白的表达呈剂量依赖性，被显着抑制，即75 g / kg和150 g / kg的作用明显优于37.5 g。 /公斤。但是，75 g / kg和150 g / kg之间没有显着差异，我们推测可能已经达到剂量反应曲线的平稳区域。此外，免疫荧光共聚焦激光分析显示，LPS注射后，NF-κBp65被转移到细胞核中，并且NF-κB信号通路被激活。 LDP也抑制了NF-κB的核转位。这些结果与蛋白质印迹结果一致并且直观可见。这些结果表明，LDP通过抑制NF-κB活化来防止LPS诱导的AKI。

这项研究有很多局限性。首先，尽管我们发现LDP对LPS诱导的AKI具有保护作用，但这仅在预处理之后，而不是治疗作用。由于中药成分复杂，特定成分可能是原始物质或代谢产物，因此中药的给药期相对较长，大多数中药具有时效性。 LDP是否对LPS诱导的小鼠AKI具有治疗作用还需要进一步探讨。另外，不清楚LDP中的哪种成分介导了这些作用。这需要进一步的分离，纯化和鉴定以获得活性成分。尽管这项研究表明LDP可以通过抑制NF-kB信号通路的激活来减轻LPS诱导的AKI，但它是否会对其他相关通路和靶标产生影响尚待确定。

在以前的研究中，我们使用HPLC-UV方法[16-18]确定了LDP的某些成分。在这些成分中，绿原酸通常用于中国药典中金银花的质量控制。同样，替尼泊苷用于for子的质量控制，丹皮酚用于牡丹皮的质量控制，大黄酸，大黄素和大黄酚的质量控制。在利胆排毒片中，茵陈、丹参、栀子是主要成分。因此，通过HPLC测定了主要有效成分绿原酸，替尼泊苷和丹酚酸B，以进行定性鉴定和定量测定。中草药配方的化学成分是其功效的物质基础。中草药配方注重药物之间的相互作用，因此是多目标，多成分和多效的制剂[30]。在先前的研究中，我们还发现LDP在体内和体外具有良好的抗内毒素作用。但是，抗内毒素作用的机制仍不清楚。因此，我们进行了这项研究，以探索LDP的作用机理。

5.结论

总之，我们证明了LDP抑制炎性细胞因子的产生，减少病理损伤并抑制NF-κB信号通路的激活。 因此，LDP可以有效减少LPS引起的AKI，可能成为中药AKI的潜在替代疗法。

利益冲突

鸣谢

参考文献：详见原文。