Overexpression of let‑7a increases

自噬表型

let-7a的过表达通过调节自噬增加了老年痴呆症PC12细胞模型的神经毒性

Overexpression of let-7a increases neurotoxicity in a PC12 cell model of Alzheimer's disease via regulating autophagy

摘要

β淀粉样蛋白（Aβ）蛋白的沉积增加是阿尔茨海默氏病（AD）的典型特征之一。最近的证据表明，在中枢神经系统中高度表达的microRNA let 7家族参与了AD病理过程的调节。在本研究中，评估了PC12和SK N SH细胞中let 7a过表达对Aβ140诱导的神经毒性的影响。结果表明，let 7a的过表达增强了PC12和SK N SH细胞中Aβ140诱导的神经毒性。另外，Aβ140诱导的PC12细胞和SK N SH细胞的凋亡通过让7a过表达而增加。此外，Aβ140处理可增加微管相关蛋白1A / 1B轻链3（LC3）和Beclin 1的蛋白水平，并提高LC3 II / I比。在PC12细胞中，Aβ140处理也增加了Beclin 1，自噬蛋白5（Atg 5）和Atg 7的mRNA表达水平。让7a过表达进一步上调上述自噬相关标记。此外，通过Aβ140处理增加了p62的蛋白质水平，并且通过7a过表达进一步提高了p62的蛋白质水平。最后，本发明结果表明雷帕霉素的磷酸肌醇3激酶（PI3K）/ Akt /哺乳动物靶标（mTOR）信号转导通路参与了let 7a的自噬调节。总之，本研究表明，通过自噬的调节，let 7a的过表达增强了Aβ1-40诱导的神经毒性，而PI3K / Akt / mTOR信号通路在此过程中也发挥了作用。

引言

阿尔茨海默氏病（AD）是痴呆症最普遍的疾病，其特征是慢性，进行性神经退行性疾病（1）。随着人口老龄化趋势的加快，AD的发病率正在上升。根据流行病学数据，到2050年，美国的AD患者人数将是2010年的三倍以上（2），而在中国可能会看到类似的趋势（3）。AD的主要病理变化是神经原纤维缠结，老年斑沉积和神经元细胞死亡。β淀粉样蛋白（Aβ）已被证明是老年斑中的关键成分，tau蛋白的过度磷酸化已被证明可促进神经原纤维缠结（4,5）。

在最近的几十年中，自噬在AD发展中的作用引起了广泛的关注。越来越多的证据表明自噬是AD发展中的一把双刃剑（6）。尽管大量研究表明自噬对AD具有有益作用（7-9），但自噬异常也可能是AD的主要危险因素（10）。已证明Aβ142或Aβ140及其前体淀粉样蛋白前体蛋白（APP）和β切割的APP的羧基末端结构域富含自噬空泡（AVs），这些空泡在自噬异常中积聚（11）。此外，一些学者认为，未成熟的房室大量积聚表明房室的运输和向溶酶体成熟的失败（12，13）。导致**积累和溶酶体蛋白水解缺陷的自噬溶酶体途径功能失调发生在整个AD脑的神经突中（14）。Cho等人（15）最近证明，**的大量积累是AD中Aβ产生的原因。因此，自噬缺陷有助于AD的进程。

据报道，microRNA（miRNA）的异常表达与AD的发病机理密切相关。 let 7 miRNA家族首先在秀丽隐杆线虫中鉴定，在多个物种中高度保守（16）。Let 7被称为经典的发育调节剂，参与各种生理和病理事件的调控，例如细胞增殖，分化，凋亡，免疫反应，肿瘤发生和转移（17）。Dubinsky等人（18）最近报道，让7 miRNA在体外和体内大脑的初级皮层神经元中促进自噬。此外，在兔模型中，在AD的进程中，let 7a，let 7b和let 7e的表达上调（19）。但是，发现AD患者血浆样品中let 7d和let 7g的表达下调（20）。目前，尚未确定let 7a对AD过程中自噬的影响。在本研究中，使用Aβ140治疗的肾上腺嗜铬细胞瘤PC12和人神经母细胞瘤SK N SH细胞系建立体外AD模型。研究了let 7a对Aβ140诱导的神经毒性的影响。可以确定，let 7a的过表达通过调节自噬作用加剧了PC12和SK N SH细胞中Aβ140诱导的损伤。

材料和方法

细胞培养和治疗

PC12和SK N SH细胞购自中国科学院上海典型培养物保藏中心细胞库。PC12细胞维持在补充有10％胎牛血清（FBS; SH30084.03; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences; Logan，UT）的RPMI 1640（31800 014; Gibco; Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA）中，美国）100 U / ml青霉素和100 U / ml链霉素。将SK-N-SH细胞维持在补充有10％FBS，100U / ml青霉素和100U / ml链霉素的基本培养基（MEM，41500034，Gibco； Thermo Fisher Scientific，Inc。）中。将两种细胞系在37℃，5％CO 2的潮湿气氛下培养。将Aβ140（GL Biochem，Ltd.，中国上海）溶解在无菌PBS中，并在37℃下孵育5天以诱导聚集。将4×1000细胞/孔的PC12和SK-N-SH细胞接种在6孔板中，然后在37℃下用500nMAβ140处理7天，以建立AD模型。

瞬时转染

let-7a模拟的和加扰的阴性对照miRNA（miR NC）从上海基因制药有限公司（中国上海）获得。序列如下：让7a模拟，5'-UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGUU-3'； miR NC 5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3'。按照制造商的规程，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen; Thermo Fisher Scientific，Inc.）用100 pmol let 7a模拟物或miR NC转染Aβ140处理过的PC12和SK-N-SH细胞。将细胞分为对照组，Aβ1-40，Aβ1-40+ let 7a模拟和Aβ140 + miR NC四组。转染后24或48小时收集细胞用于各种测定。

RNA提取和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

转染后24小时，按照制造商的操作规程，使用TRIzol试剂（Invitrogen； Thermo Fisher Scientific，Inc.）提取PC12细胞和SK N SH细胞的总RNA。为了进行mRNA分析，按照制造商的方案，使用PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒（Takara Bio，Inc.，Otsu，Japan）合成cDNA。对于miRNA分析，使用miScript逆转录试剂盒（Qiagen GmbH，希尔登，德国）按照制造商的方案合成cDNA。然后，在7500 Real Time PCR系统（Applied Biosystems； Thermo Fisher Scientific，Inc.）中使用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒（Takara Bio，Inc.）进行qPCR。热循环条件包括：在95℃变性10分钟，在95℃变性10秒，在60℃退火20秒，在72℃延伸30秒40个循环。使用的引物序列列于表I。在三个重复的实验中，分别使用2-ΔΔCq方法将mRNA和miRNA的表达水平标准化为内部对照β肌动蛋白和U6（21）。

MTT测定

在转染后48小时进行MTT测定以评价细胞活力。简而言之，将3×1000 PC12和SK N SH细胞/孔接种在96孔板中，并进行上述处理。随后，将浓度为5 mg / ml的20μlMTT（Sigma Aldrich； Merck KGaA，德国达姆施塔特）添加到每个孔中。在37℃下孵育4小时后，弃去培养基，并向每个孔中加入200μlDMSO。溶解甲maz结晶产物，并使用酶标仪在490 nm下测量光密度。

Hoechst 33342染色

转染后48小时，进行Hoechst 33342染色以评估凋亡核的形态变化。将2×1000000 PC12和SK-N-SH细胞/孔接种到6孔板中，并进行上述处理。将细胞在室温下用4％多聚甲醛固定20分钟。随后，将细胞用PBS洗涤，并与10μg/ ml的Hoechst 33342在37℃温育5分钟。用PBS洗涤3次，每次3分钟后，在荧光显微镜下以x400的放大率观察细胞。与正常细胞核相比，凋亡细胞核出现凝缩或破碎。

流式细胞仪用于细胞凋亡分析

转染后48小时，使用Annexin V异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒（KGA106； KeyGen Biotech Co.，Ltd.，南京，中国）定量PC12细胞凋亡的百分比，根据制造商的协议。简而言之，将不同组的2x1000000细胞用PBS洗涤，在室温下黑暗中用Annexin V‑FITC和PI染色15分钟。然后使用流式细胞仪（BD Accuri C6； BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞）分析样品（10,000个细胞/样品）。

蛋白质印迹分析

转染后48小时，进行蛋白质印迹分析。使用了以下一抗：抗磷酸肌醇3激酶（PI3K）（1：500; WL02240; Wanleibio，Co.，Ltd.，沉阳），抗Akt（1：500; WL0003; Wanleibio，Co.，Ltd ），抗磷酸化（p）-Akt（1：500; WLP001; Wanleibio，Co.，Ltd.），雷帕霉素的抗哺乳动物靶标（mTOR; 1：200; sc 101738; Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Dallas，美国德克萨斯州），抗pTOR（sc 8319; 1：200;圣克鲁斯生物技术有限公司），抗微管相关蛋白1A / 1B轻链3（LC3; 1：500; WL01506; Wanleibio，Co.，Ltd. ），抗beclin 1（1：500; WL02237; Wanleibio，Co.，Ltd.），抗p62（1：500; WL02385; Wanleibio，Co.，Ltd.），抗β肌动蛋白（1：500; WL01845; Wanleibio ， 有限公司）简要地，用RIPA裂解缓冲液（Beyotime生物技术研究所，海门，中国）裂解细胞。使用BCA方法确定蛋白质浓度。将每种样品（20μg）中的蛋白质通过8％，10％或13％SDS PAGE分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜用5％脱脂奶粉在室温下封闭1小时，并与一抗在4℃下孵育过夜。随后，在室温下添加IgG缀合的山羊抗兔抗体（1：5,000; WLA023; Wanleibio Co.，Ltd.）或IgG缀合的山羊抗兔抗体（1：5,000; WLA024; Wanleibio Co.，Ltd.）二抗在室温下放置30分钟温度。使用增强的化学发光检测试剂（Beyotime生物技术研究所）显影印迹。在三个重复的实验中，使用Gel Pro Analyzer 4软件（Media Cyber​​netics，Inc.，Rockville，MD，美国）进行的扫描光密度法评估每种靶蛋白相对于β肌动蛋白的水平。

免疫荧光染色

简而言之，在转染后48小时，将来自不同处理组的2x1000000 PC12细胞铺在玻片上，并在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟。用PBS洗涤3次，每次5分钟后，将细胞在室温下用0.1％Triton X 100渗透30分钟，然后用10％的正常山羊血清封闭（北京索拉比生物科技有限公司，北京） ，中国）在室温下放置15分钟。随后将细胞与1：200稀释的一抗LC3（WL01506; Wanleibio，Co.，Ltd.）在4 C孵育过夜。用PBS洗涤3次后，将细胞与Cy3缀合的二抗（稀释度1：200； A0516； Beyotime生物技术研究所）一起温育30分钟。在室温下用DAPI将细胞核染色5分钟。通过免疫荧光显微镜（BX53； Olympus Corp.，东京，日本）以400倍的放大倍数观察载玻片。

PC12细胞中自噬的抑制

为了抑制自噬，将PC12细胞（2x1000000个细胞/孔）与自噬抑制剂3甲基腺嘌呤（3 MA； 1 mM； Sigma Aldrich； Merck KGaA）在37℃下孵育1 h，然后用7a模拟物转染。将细胞分为五组：对照组，Aβ1-40，Aβ1-40+ let-7a模拟物，Aβ1-40+ miR-NC和Aβ1-40+ let 7a模拟物+ 3-MA。

PC12细胞中PI3K / Akt / mTOR途径的激活

为了诱导PI3K / Akt / mTOR途径的激活，将不同处理的PC12细胞用100 ng / ml胰岛素样生长因子1（IGF 1； Bachem AG，Bubendorf，瑞士）处理，然后在37℃转染48 h。将细胞分为五组：对照组，Aβ1-40，Aβ1-40+ let 7a模拟物，Aβ1-40+ miR-NC和Aβ1-40+ let-7a模拟物+ IGF-1。

统计分析

数据表示为平均标准偏差。组间的差异通过方差分析的一种方法进行评估，然后使用GraphPad Prism 5软件（GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA，USA）进行Bonferroni的多重比较测试。P <0.05被认为指示统计学上的显着差异。

结果

let-7a在PC12和SK-N-SH细胞中的表达。

图1 let-7a模拟转染对Aβ140处理的（A）PC12和（B）SK-N-SH细胞中let 7a表达的影响。通过逆转录定量聚合酶链反应评估let 7a的水平。数据表示为平均标准偏差（n = 3）。*** P ＜0.001，相对于Aβ1-40组； P ＜0.001，相对于Aβ1-40+ let-7a模拟组。Aβ，β淀粉样蛋白； miR NC，阴性对照microRNA。

let-7a对Aβ1-40处理的PC12和SK-N-SH细胞中细胞活力的影响。

图2 let-7a过表达对Aβ1-40处理的（A）PC12和（B）SK-N-SH细胞的细胞活力的影响。

细胞存活力通过MTT测定法确定。数据表示为平均标准偏差（n = 5）。 ***与对照组相比，P <0.001； 与Aβ140组相比，＃P <0.05，### P <0.01。 ; P <0.05vs.Aβ1-40+让7a模拟组。Aβ，β淀粉样蛋白； miR NC，阴性对照microRNA； OD，光密度。

let-7a对Aβ1-40处理的PC12和SK-N-SH细胞凋亡的影响。

图3 let-7a的过表达促进了Aβ1-40处理的PC12和SK N SH细胞的凋亡。通过流式细胞术对膜联蛋白V / PI染色用于确定（A）PC12和（B）SK-N-SH细胞的凋亡率。柱状图中显示了UR和LR象限中凋亡细胞的百分比。（C）通过Hoechst 33342染色评估PC12和SK-N-SH细胞核的形态变化，并显示代表性图像（放大倍数，x400）。数据表示为平均标准偏差（n = 3）。 与对照组相比，* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001； ### P <0.001 vsAβ140组； 与Aβ140 + let-7a模拟组相比，&& P <0.01，&&& P <0.001。UR，右上； LR，右下； Aβ，β淀粉样蛋白； miR NC，阴性对照microRNA。

图4 let 7a过表达对Aβ1-40处理的PC12和SK H SN细胞中LC3，beclin 1和p62蛋白表达的影响。（A）通过免疫荧光染色评价PC12细胞中LC3的表达。（B）通过蛋白质印迹分析评估PC12细胞中LC3 I，LC3 II，beclin 1和p62的蛋白水平。 β肌动蛋白用作负载对照。（C-E）每个蛋白质条带的光密度分析。（F）通过蛋白质印迹分析评估SK H SN细胞中LC3 I和LC3 II的蛋白水平。 β肌动蛋白用作负载对照。（G）每个蛋白质条带的光密度分析。 数据表示为平均标准偏差（n = 3）。 与对照组相比，* P <0.05，*** P <0.001； #P <0.05，## P <0.01，### P <0.001vs.Aβ140组; 与Aβ140 + let 7a模拟组相比，＆P <0.05，&& P <0.01，&& P <0.001。Aβ，β淀粉样蛋白； miR NC，阴性对照microRNA； LC3，微管相关蛋白1A / 1B轻链3。

图5 let-7a过表达对Aβ140处理的PC12细胞中beclin 1，Atg 5和Atg 7 mRNA表达的影响。通过逆转录定量聚合酶链反应评估Beclin 1，Atg 5和Atg 7在PC12细胞中的（A-C）mRNA表达。（D）用Hoechst 33342染色的PC12细胞中细胞核形态变化的代表性照片（放大倍数，x400）。（E）通过流式细胞术对膜联蛋白V / PI染色用于确定PC12细胞的凋亡率。柱状图中显示了UR和LR象限中凋亡细胞的百分比。 数据表示为平均标准偏差（n = 3）。***与对照组相比，P <0.001； ### P <0.001 vsAβ140组； &&& P <0.001 vs.Aβ140 +让7a模拟组; 如所示，$ P <0.05，$$ P <0.001。UR，右上； LR，右下； Aβ，β淀粉样蛋白； miR NC，阴性对照microRNA； Atg，自噬蛋白； 3-MA，3-甲基腺嘌呤。

图6 let-7a过表达对PI3K / Akt / mTOR信号通路的影响。（A）通过蛋白质印迹分析检测PI3K，p-Akt，Akt，p-mTOR和mTOR的蛋白质水平。 β肌动蛋白用作负载对照。（B-D）每个蛋白质条带的光密度分析。数据表示为平均标准偏差（n = 3）。与对照组相比，** P <0.01，*** P <0.001； #P <0.05vs.Aβ140组； 与Aβ1-40+ let-7a模拟组相比，＆P <0.05，&& P <0.01。Aβ，β淀粉样蛋白； miR NC，阴性对照microRNA； PI3K，磷酸肌醇3激酶； p，磷酸化； mTOR，雷帕霉素的哺乳动物靶标。

图7 PI3K / Akt途径激活对细胞凋亡和自噬的影响。（A）通过蛋白质印迹分析检测PC12细胞中PI3K，pAkt和Akt的蛋白水平。 β肌动蛋白用作负载对照。（B和C）每个蛋白条带的光密度分析。（D）通过流式细胞术确定PC12细胞中的凋亡率.（E）柱状图显示了UR＆LR象限中凋亡细胞的百分比。（F）用Hoechst 33342染色的PC12细胞中细胞核形态变化的代表性图像（放大倍数，x400）。（G）通过蛋白质印迹分析检测LC3 I和LC3 II的蛋白质水平。 β肌动蛋白用作负载对照。（H）每个蛋白质条带的光密度分析。数据表示为平均标准偏差（n = 3）。如所示，* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001。UR，右上； LR，右下； Aβ，β淀粉样蛋白； miR NC，阴性对照microRNA； LC3，微管相关蛋白1A / 1B轻链3； PI3K，磷酸肌醇3激酶； IGF-1，胰岛素样生长因子-1。

讨论

鸣谢

利益冲突

参考文献：详见附件原文。

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