protocol 分享｜细胞转染和分析（稳转；瞬转）

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根据某个基因在细胞内表达时间的长短或该基因整合进细胞内的方式，细胞转染可分为瞬时转染和稳定转染。

瞬时转染指的是：通过脂质体、磷酸钙、电穿孔等方法，将构建好的质粒通过转染试剂导入到细胞内，该质粒上的外源基因不整合到细胞自身的基因组上。随着细胞的生长分裂，外源基因逐渐丢失。质粒在细胞内能够存在 3-4 天，此时间内，质粒外源基因在细胞内发生转录翻译，得到极为少量的蛋白。

稳定转染通常指的是利用病毒载体，将外源基因整合到细胞基因组上，通过筛选得到稳转细胞株，使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制，能够长期的表达某基因。

一、材料

以293T细胞为例介绍PEI转染法

1、293T细胞，待感染的细胞

2、HBS溶液，PEI转染试剂，0.45μm滤头，5mL注射器，pb促感染试剂

3、离心机，涡旋仪

二、步骤

瞬时转染法：

1、提前一天晚上将 293T 细胞铺板至6 cm 皿中，铺板量以转染时达到 80% 左右为宜；

2、转染细胞。准备两个 EP 管，一个加入240 μL HBS 以及待转染的质粒，另一管加入155 μL HBS以及 25 μL PEI 转染试剂，在涡旋混合仪上震荡混匀两管，静置5分钟；

3、将两个 EP 管里面的液体混合至一个管子中，再次震荡，室温静置 15 分钟；

4、在超净台中，将转染体系加入至 293T 细胞中，混匀培养基和转染体系，放入培养箱中，继续培养，

5、6 小时后更换新鲜的培养基，24 小时后检测基因的表达情况。

稳定转染法：

1、稳转之前需得到病毒液，只需要将上述瞬转步骤中的质粒换成相应的病毒载体质粒以及病毒衣壳蛋白的表达质粒；

2、换液后，继续培养 48 小时，在生物安全柜中取出培养基至 5 mL EP管，离心后，转移至5 mL注射器中，通过0.45 μm 滤头过滤病毒，并分装至 1.5mL EP 管中；

3、感染前一天晚上将细胞铺板至 6 孔板中，密度至感染时达到 50%-60%，将过滤的病毒和培养基以 1:1 的比例加入细胞中，并加入 2 μL pb促感染;

4、感染 48 小时后，消化细胞并用相应的抗生素进行筛选；

5、传 2-3 代后，检测细胞稳转的效率。

三、注意事项

1、每一种试剂都有相应的实验步骤，不同的细胞应该根据其特性，选择经济高效的转染试剂；

2、稳转过程中会产生病毒，需要在生物安全柜以及有相应资质的实验室进行，相应的器皿不能随意丢弃，应集中回收灭菌后在丢弃。

四、常见问题

1、转染效率低或者检测不到表达？

1）确认该质粒构建无误；

2）提高转染质粒的质量；

3）调整转染时细胞密度以及转染试剂的用量；

4）更换转染试剂或用稳转的方法。 

2、血清影响复合物的形成，降低转染效率：

原因是阳离子脂质体和 DNA 的最佳量在使用血清时会有所不同，因此想在转染培养基中加入血清时要进行条件优化。

大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康，对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用 OPTI-MEM I 培养基。对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用 LIPOFECTAMINE 2000。

3、抗生素的影响：

比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。

4、细胞代数的影响：

转染前细胞最好经过 1-2 次传代保证细胞生长旺盛容易转染，注意贴壁细胞一旦长满就不好转染。

5、细胞铺板密度的影响：

一般转染时，贴壁细胞密度为 70%-90%，悬浮细胞密度为 2*10⁶--4*10⁶ 细胞/ml 时效果较好。确保转染时细胞没有长满或处于静止期。铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。

6、DNA 质量的影响：

DNA 质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术基于电荷吸引原理，如果 DNA 不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显着影响转染复合物的有效形成和转染的进行

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