JAKSTAT pathway in nucleus pulposus cell

白介素-17通过激活髓核细胞中的JAK/STAT通路上调血管内皮生长因子

摘要

目的：椎间盘（IVD）相关疾病和年龄相关的IVD变性是导致严重发病的原因。炎性介质和促炎细胞因子，包括白介素（IL）-17，在变性椎间盘组织中表达升高。据报道IL-17主要通过Janus激酶/信号转导子和转录激活子（JAK / STAT）信号转导途径转导整个细胞膜的信号，从而导致靶基因的转录激活。 JAK / STAT通路在IVD的髓核（NP）细胞中IL-17介导的信号传导中起作用。血管内皮生长因子（VEGF）和IL-17被发现在人类变性NP组织中高表达。在分离的大鼠NP细胞中，IL-17诱导的VEGF表达呈时间和剂量依赖性。大鼠NP细胞与VEGFpromoter质粒以及组成型活性STAT1，STAT3或JAK2质粒一起共转染。发现在IL-17处理的细胞中，STAT1，STAT3和JAK2增加了VEGF启动子的活性。用STAT1或STAT3慢病毒短发夹RNA转染培养的大鼠NP细胞或用JAK2抑制剂AG490进行处理可显着降低IL-17刺激的VEGF表达。人类退化的NP组织中存在IL-17和VEGF的水平。这些发现为IVD变性的病理学提出了新的见解。

1.引言

疾病引起的椎间盘（IVD）变性会给医疗保健系统带来巨大负担。 IVD有助于负荷支持和灵活性，包括两种无血管组织类型，即髓核（NP）和纤维环（AF）。 IVD构成人体中最大的无血管组织类型，无血管性对于IVD功能和体内平衡至关重要。最近的研究提出了对缺氧条件下椎间盘细胞生存所需蛋白质的见解[1]。

NP是富含软骨源性细胞外基质蛋白的凝胶状组织，在脊柱的稳定性和柔韧性中起着至关重要的作用。脊柱的这些特征随着年龄的增长而恶化，这表明NP的稳态可能随着年龄的增长而下调，或者NP随着年龄的增长而退化。据报道，某些炎症介质和促炎细胞因子在退化的，突出的IVD组织中升高，例如白介素（IL）-6，IL-8，前列腺素E2和一氧化氮[2]。此外，还发现在IVD病理学检查过程中，病理相关的细胞动力学坏死因子α（TNF），干扰素γ（IFNγ）和IL-1β升高[3-7]。此外，在突出的IVD组织中检测到细胞间粘附分子1（ICAM-1）[8]提示免疫效应细胞的ICAM-1募集。因此，越来越多的证据表明炎症在介导IVD变性中发挥了作用。

Gabr等人的最新工作。提示从变性和突出的IVD获得的组织中IL-17的表达升高[9]，这表明IL-17在IVD病理中也起作用。 CytokineIL-17先前已被报道为炎性途径的介体[9,10]和Gabr等人。报道说，该细胞因子通过上调IVD细胞中的炎性介质ICAM-1和共刺激物IFNγ和TNF来指导炎症表型。细胞因子（例如IL-17）和生长因子主要通过Januskinase /信号转导子和转录激活子（JAK / STAT）途径在整个细胞膜上转导信号。酪氨酸激酶的JAK家族（JAK 1、2、3和Tyk 2）与跨膜受体相关，并在配体-受体结合后被激活。然后，活化的JAK募集并磷酸化一种或多种STAT蛋白（STAT1-6）。酪氨酸磷酸化的STATs发生二聚化，易位至细胞核并结合特定的启动子元件来调节基因表达[11]。因此，STAT蛋白具有信号转导和转录激活剂的双重作用。在这项研究中，我们调查了JAK / STAT通路是否在NP细胞中IL-17介导的信号传导中起作用。我们的发现为VEGF在NP组织中的作用提出了新的见解，并暗示了与IVD病理的联系。

2.方法

2.1 患者和对照本研究中包括的患者已被诊断患有椎间盘退变并正在接受椎间盘切除术（变性组，n = 20）。还包括没有变性证据的正常对照（非变性组，n = 20）。表1列出了我们样本人群的年龄，性别和椎间盘退变程度的信息。确定了椎间盘退变的程度根据Pfirrmann分级系统[12]。选择患者的标准为：典型的腰痛或坐骨神经痛； Lasegue征或Bra-gard检验的阳性；变性椎间盘X线厚度的减少，生理性脊柱弯曲的减少或消失，T2加权MRI分析中所涉及的NP信号的减少以及CT上无钙化迹象;没有结核病，类风湿性关节炎或其他免疫疾病的存在，也没有糖皮质激素的近期使用史[13]。

表1 本研究纳入的患者(退化组)和健康个体(非退化组)的特征。

手术前，从患者和正常对照中获取外周血样品。在手术期间从患者和正常对照中获得椎间盘组织样品。所有实验程序均经长征医院批准，并获得所有研究参与者的书面知情同意。

2.2免疫组织化学

从我们每个患者（退化组，n = 20）和正常对照组（非退化组，n = 20）中获得IVD组织样本。手术中获得的样品用无菌生理盐水冲洗3次以去除所有残留血液。将NP组织小心地从AF上分离，并固定在PBS中4％多聚甲醛中，然后石蜡包埋。切片的厚度为6-8μm。在烤箱中加热1小时，用二甲苯醇脱石蜡，然后以降序的梯度乙醇系列再水化。用3％过氧化氢封闭切片中的内源性过氧化物酶，并在EDTA（1：50，ZSGB-Bio，China）中于95℃微波干燥切片15分钟，进行抗原回收。用20％的山羊血清封闭非特异性蛋白后（ZSGB-Bio），将抗VEGF和IL-17的一抗应用于该切片，并在4℃孵育过夜。将合适的同种型匹配的抗体用作同种型对照。洗涤后，将切片与二抗（Abcam）在室温下孵育30分钟。然后，在室温下将叔连接基0,0-二甲基-0-2,2-二氯乙烯磷酸酯施加20分钟。用3，3'-二氨基联苯胺（Abcam）检测染色。用蒸馏水冲洗后，将切片脱水，以梯度乙醇系列和二甲苯醇脱水。将盖玻片与合成的基于二甲苯的安装介质一起使用。使用IX71-SIF型显微镜（日本奥林巴斯）和ImagePro Plus 5.0软件（Media Cyber​​netics，MD，美国）检查部分。每个载玻片分析三个随机选择的显微镜视野，并将平均密度定义为IL-17和VEGF的表达强度。

2.3髓核（NP）细胞的分离大鼠NP细胞是根据以前发表的协议分离的[1]。简而言之，对雄性Wistar大鼠（225-250 g）进行食道麻醉，并无菌取出脊柱。将lumbarIVD从脊柱中分离出来，然后使用解剖显微镜从AF中分离出凝胶状NP，并用0.2％胰蛋白酶和0.2％II型胶原酶消化4-6小时。将部分消化的NP组织保持为外植体inDulbecco改良的Eagle培养基和10％的胎牛血清在37％的含5％CO2的潮湿环境中补充了抗生素。 1周后，NP细胞迁移出外植体。汇合后，使用0.25％胰蛋白酶EDTA（1 mM）溶液收集细胞，并在10厘米培养皿中继代培养。为了进行检测，将NP细胞用IL-17（R＆D Systems）处理，最佳浓度为10 ng / mL持续8、24和48小时，或在一系列IL-17浓度（0、2、5、10、50和100 ng / mL）持续24 h。

2.4蛋白质印迹分析

通过SDS-PAGE在10％凝胶上分离蛋白质，并通过电印迹将其转移至硝酸纤维素膜（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。 膜用TBST（50 mM Tris [pH 7.6]，150 mM NaCl，0.1％Tween 20）中的5％脱脂奶粉封闭。 然后，将膜与购自Santa CruzBiotechnology的抗p-STAT1，STAT1，p-STAT3，STAT3，p-JAK2，JAK2和VEGF的抗体在4％TBST中的3％脱脂奶粉中孵育过夜。 使用ECL试剂（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ，美国）检测免疫标记。 使用1D图像分析软件（Eastman Kodak，Rochester，NY，USA）通过定量光密度分析法确定相对表达水平。

对于某些实验（图1），在蛋白质制备，SDS-PAGE和抗体检测之前，用10 ng / mL IL-17预处理NP细胞0、5、30、60、90和180分钟。

图1 血管内皮生长因子（VEGF）和白介素17（IL-17）在人类变性髓核组织中高表达。 对来自退化患者组和非退化对照的椎间盘（IVD）组织切片进行VEGF和IL-17的免疫组织化学染色。 包括IgG染色作为对照。 表达水平以阳性细胞的平均密度进行测量。** P <0.01与未变性组相比。 qRT-PCR分析以分析变性患者组和非变性对照组的IVD组织中IL-17和VEGF mRNA的表达水平。** P <0.01与非变性组相比。

2.5实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析

使用RNeasy微型色谱柱（Qiagen，Chatsworth，CA，USA）从6厘米板（5×10000细胞/板）中培养的NP细胞中提取总RNA，并用无RNase的DNase I处理。总RNA（100 ng）作为 实时PCR分析的模板。 反应包含1μLRNA，9μLLightCycler FastStartDNA Master SYBR Green I混合物（罗氏，印第安纳波利斯，美国，美国）和基因特异性正向和反向PCR引物。 VEGF正向和反向引物分别是5'-ATCCAATCGAGACCCTGGTG-3'和5'-ATCTCTCCTATGTGCTGGCC-3'。 IL-17正向和反向引物分别是5'-TGTCCACCATGTGGCCTAAGAG-3'和5'-GTCCGAAATGAGGCTGTCTTTGA-3'。 根据制造商的说明，在LightCycler（Roche）中进行PCR反应。

2.6酶联免疫吸附测定（ELISA）

根据制造商的方案，使用VEGF ELISA试剂盒（Abcam，Cambridge，MA，USA）定量无细胞上清液中的VEGF蛋白表达水平。所有步骤均在室温下进行，一式两份检测平均吸光度。在酶标仪（Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）上于450 nm进行比色分析。

2.7通过RNA干扰在原代培养NG中基于慢病毒的基因沉默小干扰

设计并构建了慢病毒发夹RNA（shRNA）载体RNA，以沉默大鼠NP细胞中STAT1和STAT3的表达。简而言之，用STAT1或STAT3 shRNA（Santa Cruz Biotech-nology，Santa Cruz，CA，美国）或对照shRNA（针对一个无关基因设计）转染NP细胞，以5.0 7.5 104细胞/孔的密度培养24孔板24小时。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，San Diego，CA，USA），终浓度为50100 nM。转染六小时后，将培养基替换为完全的生长培养基，并使细胞恢复18小时。然后将细胞在正常或缺氧条件下再培养24小时，然后测定萤光素酶活性。

2.8转染和双重荧光素酶测定

用500 ng报告基因质粒和500 ng与转染试剂Lipofec-tamine 2000（Invitrogen）预混合的500 ng对照质粒pRL-TK处理在24孔板中培养的NP细胞（5.0 7.5 * 10000 /孔）。 H。然后将细胞转移至缺氧室或在正常条件下保持24小时。将收获的细胞用于双萤光素酶报告测定系统（Promega，麦迪逊，威斯康星州，美国）中，以特定底物顺序测量萤火虫和海参萤光素酶活性。使用发光计（TD-20 / 20； Turner Designs，Sun-nyvale，CA，USA）定量荧光素酶活性并计算相对比例。

2.9统计分析数据

以平均值±标准差表示。使用Student的t检验分析数据，P值<0.05被认为具有统计学意义。单向方差分析，然后通过最小显着性差异（LSD）对子组进行多重比较检验，以比较多个组之间的均值。

3.结果

3.1 VEGF和IL-17在人变性NP组织中高表达对患者（变性组）和正常对照组（非变性组）的IVD组织切片进行免疫组织化学染色，分析VEGF和IL-17的表达水平。 测定阳性细胞的平均密度表明，与非变性对照组相比，变性患者组中VEGF和IL-17的表达水平均显着增加（P ＜0.01）（图2A）。 qRT-PCR证实了这些结果，结果表明，与未变性对照组相比，变性患者组中VEGF和IL-17的mRNA表达也显着增加（P <0.01）（图2B）。

图2 大鼠髓核细胞中白细胞介素17（IL-17）上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达。A和B在以下处理的髓核（NP）细胞中进行VEGF相对表达水平的实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析：（A）0,2，5，10，50，100 ng / mL的IL-17 24小时，或（B）10 ng / mL的IL-17 0、8、24和48 h。C.通过蛋白质印迹法在用0、2、5、10、50和100 ng / mL IL-17处理24小时的NP细胞中分析VEGF蛋白的表达水平。蛋白质印迹结果以β-肌动蛋白标准化。D和E.进行ELISA定量从无NP处理的NP细胞收获的无细胞上清液中的VEGF蛋白表达：（D）10 ng / mL IL-17进行8，24，48 72 h，（E）0， 1、10、100、1000 ng / mL的IL-17持续24 h。数据代表至少三个独立的实验，一式两份，并显示了平均mRNA或蛋白质水平和标准差（SD）。通过最小显着性差异分析（LSD）检测到显着差异（P <0.05）。与未治疗组相比，* P <0.05，** P <0.01。

3.2 IL-17上调大鼠NP细胞中VEGF的表达

接下来，通过实时RT-PCR分离大鼠NP细胞，并在48小时的时间过程中响应IL-17（10 ng / mL）处理来分析相对VEGF表达水平（图3A和B）在IL-17处理的大鼠NP细胞中，VEGF mRNA表达以剂量依赖性（图3A）和时间依赖性方式（图3B）显着增加。使用相同范围的IL-17浓度（0 100 ng / mL）持续24小时），通过蛋白质印迹分析在蛋白水平上分析VEGF表达（图3C）。在IL-17处理的大鼠NP细胞中，VEGF蛋白表达也以剂量依赖性方式显着增加。

为了证实这些发现，收获了无细胞的上清液并通过ELISA定量了VEGF蛋白的表达水平。在大鼠NP细胞的IL-17处理的无细胞上清液中，发现VEGF蛋白表达以时间依赖性（图3D）和剂量依赖性（图3E）增加。观察到在长达72 h时VEGF蛋白表达增加，并在IL-17达到100 ng / mL时达到峰值，在1000 ng / mL时表达降低。总之，这些发现表明IL-17在时间和剂量依赖性下上调VEGF的表达,大鼠NP细胞。

图3 白介素17（IL-17）通过JAK / STAT途径上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达。 蛋白质印迹分析NP全细胞中JAK / STAT通路成分的表达：细胞STAT1，磷酸化STAT1（p-STAT1），STAT3，磷酸化STAT3（p-STAT3）和JAK2，磷酸化JAK2（p-JAK2）。 用IL-17处理细胞，并在180分钟内监测表达水平。 Western印迹结果以β-肌动蛋白标准化。* P <0.05，** P <0.01，与各组0min相比。

3.3 IL-17通过JAK / STAT途径上调VEGF表达

为了研究IL-17上调VEGF表达的机制，进行了蛋白质印迹分析以分析全细胞中JAK / STAT通路成分的表达（图1）.IL-17（10 ng / mL）预处理的细胞在180分钟内进行了分析，检测到以下蛋白：STAT1，磷酸化STAT1（p-STAT1），STAT3，磷酸化STAT3（p-STAT3），JAK2和磷酸化JAK2（p-JAK2）。活化（磷酸化）与失活蛋白的相对表达水平表明，所有活性成分的表达均增加，IL-17处理可显着诱导p-STAT1，p-STAT3和p-JAK2。在经IL-17处理的细胞中，JAK / STAT通路的组成部分进行了双重荧光素酶报告基因检测（图4A-C）。 NP细胞与VEGF启动子质粒以及数量不断增加的（0-4μg）组成性活性（CA）STAT1质粒（pCA-STAT1），pCA-STAT3质粒或pCA-JAK2质粒一起共转染。用或不用IL-17处理共转染的细胞，培养24小时，并测量报道分子活性。荧光素酶活性的相对比值表明IL-17通过JAK / STAT途径调节了VEGF启动子的活性，涉及STAT1，STAT3和JAK2。

图4 白介素17（IL-17）通过JAK / STAT途径调节血管内皮生长因子（VEGF）启动子的活性。 A–C。 将髓核（NP）细胞与VEGF启动子质粒以及增加量（0–4 g）的组成性活性（CA）STAT1质粒（pCA-STAT1），pCA-STAT3质粒或pCA-JAK2质粒共转染 -荧光素酶报告基因分析。 用或不用10ng / mL IL-17处理细胞并培养24小时，并测量报道分子活性。 值是一式三份进行的三个独立实验的平均值和SD。与未处理的对照相比，* P <0.05，** P <0.01。

3.4 JAK / STAT途径的沉默成分抑制IL-17刺激的VEGF表达

为了进一步分析JAK / STAT通路成分表达的变化，用逆转录病毒STAT1和STAT3 shRNA转染NP细胞，并用IL-17处理（图5A）。 Western-印迹分析证实了转染的NP细胞中STAT1和STAT3表达的抑制（P <0.01）。然后，对经或不经IL-17处理并经逆转录病毒STAT1 / STAT3shRNA或对照RNA转染的NP细胞中的VEGF mRNA水平进行实时RT-PCR分析（图5B）。结果表明，STAT1或STAT3 shRNA转染可抑制IL-17刺激的NP细胞VEGF表达（P <0.01）。接下来，我们通过实时RT-PCR测试了JAK2抑制剂AG490对IL-17刺激的VEGFmRNA表达的影响（图5C）。 JAK2抑制剂（100μM）大大降低了NP细胞中IL-17刺激的VEGF表达，表明该信号分子在IL-17诱导的VEGF表达中起着至关重要的作用。对sh-STAT1，sh-STAT3和AG-490对IL-17刺激的VEGF表达的影响的蛋白质印迹分析证实了对JAK / STAT通路成分的抑制反应在蛋白水平上对VEGF表达的抑制（图5D ）。

图5 沉默STAT1或STAT3或用AG490进行治疗可抑制白介素17（IL-17）刺激的血管内皮生长因子（VEGF）的表达。A.用逆转录病毒STAT1和STAT3 shRNA转染的髓核（NP）细胞中STAT1和STAT3表达的蛋白质印迹分析。用IL-17处理细胞并培养24小时。将蛋白质印迹结果标准化为β-肌动蛋白。**与对照相比，P <0.01。B和C.实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析经或不经IL-17（10 ng / mL）和（B）反转录病毒STAT1 / STAT3 shRNA转染的NP细胞中VEGF mRNA的表达或对照RNA 24小时，或（C）用所示浓度的AG490处理24小时。D.用sh-STAT1或sh-STAT3转染或用AG-490处理的IL-17处理的NP细胞中VEGF表达的代表性蛋白质印迹。蛋白质印迹结果以β-肌动蛋白标准化。 E和F.ELISA分析IL-17处理的NP细胞的无细胞上清液，以分析转染sh-STAT1或sh-STAT3或AG-490处理后的VEGF蛋白的表达水平（pg / mL） * * P <0.05，** P <0.01与未处理的对照相比。＃P <0.05，## P <0.01与用IL-17处理的对照相比。

最后，进行ELISA以定量IL-17处理的NP细胞的无细胞上清液中响应sh-STAT1，sh-STAT3和AG-490的VEGF蛋白表达水平。图5E证实了用sh-STAT1或sh-STAT3转染将IL-17刺激的VEGF蛋白表达水平显着降低至转染对照的近三分之一（P ＜0.01）。图5F证实了用AG-490处理也将IL-17刺激的VEGF蛋白表达水平显着降低至未治疗的（Il-17刺激的）对照的三分之一以下（P ＜0.01）。因此，我们全面证明了STAT1或STAT3的沉默或抑制JAK2表达在NP细胞的mRNA和蛋白水平上抑制了IL-17刺激的VEGF表达。

4、讨论

免疫学家认为，无血管的NP组织处于免疫特权状态，一旦暴露于免疫系统，宿主的免疫系统就无法识别它。而是在NP中引起免疫反应，导致自体免疫，慢性炎症和长时间的疼痛。已经证明，产生IL-17的Th17细胞在许多不同的免疫介导的疾病和多种炎症过程的发病机理中起着重要作用[10,14]。据报道，在两种自身免疫性疾病小鼠模型，实验性自身免疫性脑脊髓炎和II型胶原诱导的关节炎[14-16]中，产生IL-17的Th17细胞与炎症有关，并且还可能介导IVD变性相关的炎症。 Shamji等。最近报道说，与Th17相关的细胞因子IL-17存在于超过70％的病理IVD组织中，Zhang等（2003）。结果表明，NP中CCL20的大量表达通过趋化性将其吸引至外周血中表达CCR6的Th17细胞进入椎间盘病变。先前对退变椎间盘的组织学研究表明，炎症细胞浸润明显，主要包括产生细胞因子的巨噬细胞。IVD病理学中还注意到炎症细胞因子水平升高，包括一氧化氮，前列腺素E2，IL-6和IL-8 [2]和病理学。相关的细胞因子，包括TNF，IFN和IL-1 [3-7]。 TNF是血管生成的有效诱导剂[17]，可以上调VEGF的表达，从而导致新血管的形成[18,19]。新形成的血管和炎性细胞浸润是与IVD病理相关的表型[19,20]。退变椎间盘的病理损伤中许多炎症细胞因子的存在促进了炎症反应并刺激了CCL20的产生，导致更多的Th17细胞趋化，并导致了阳性趋化反馈环的产生，正如Zhang等人提出的。这解释了IVD病理学的长期自身免疫性质。

以前已经证明IL-17是炎症病理的重要调节剂[9]，许多细胞类型单独或与其他促炎细胞因子（例如TNF或IFN），包括成纤维细胞，软骨细胞，巨噬细胞和滑膜细胞[21-26]。然而，IL-17和相关细胞因子诱导AF和NP细胞上调的炎症表型的机制尚待确定。先前的一项研究表明，用IL-17处理细胞似乎可以立即激活JAK 1、2和3和Tyk 2 [27]。在这项研究中，我们调查了人类退化的NP组织中VEGF和IL-17的表达，发现它们都高度表达。通过对JAK / STAT途径的组成部分的全面表达分析，我们表明该信号转导途径是响应大鼠NP细胞中IL-17上调的VEGF表达而激活的。此外，JAK / STAT途径的沉默成分抑制了IL-17刺激的VEGF表达。 IL-17是单独起作用还是需要与其他促炎细胞因子（例如TNF，IFN和IL-1）共刺激以促进炎症表型NP细胞上调尚待确定。

先前已经证明VEGF-A在NP细胞中高表达并在NP存活中起作用[28]。 NP是一种缺氧组织，在缺氧条件下VEGF-A的表达增强[29]。在正常的无血管情况下，VEGF表达的基线水平被认为与NP存活有关，而不是促进组织新血管形成。然而，在IVD变性的条件下，升高的VEGF水平将促进椎间盘病变中的血管生成和血管生成。

充分阐明IVD变性涉及的信号传导途径和效应分子对于我们了解这种病理过程至关重要。确定IL-17和/或VEGF抑制对体内IVD病理学的潜在影响将是开发治疗IVD变性疾病和与年龄有关的变性的治疗策略的下一个关键步骤。

利益冲突：无。

参考文献：详见原文。