细胞及组织样品内质网富集分离方法步骤

ER-036 Invent

描述：

内质网是连接核膜和质膜功能的主要膜结构。内质网在真核细胞蛋白转运的胞外途径中起重要作用。在细胞质中合成的蛋白质被运送到内质网，囊泡将蛋白质运送到高尔基体，然后与质膜融合。传统分离内质网的方法是基于密度梯度超离心，需要大量的起始样品，方法繁琐，耗时，交叉污染严重。目前，所有内质网分离的商用试剂盒都是基于上世纪70年代开发的方法。这个内质网分离方法使用离心管柱技术，简单、快速，只需少量的起始培养细胞或组织，不需要使用杜恩斯匀浆管和超高速离心，就能从培养的细胞/组织中分离出天然ER(主要是粗面内质网)。整个操作可以在大约2h内完成。

操作方法：

1. 将离心管柱 及接收管 套管放在冰上预冷 。

a) 培养细胞， 500-600X g收集 25-35 X 106细胞 。 用预冷的 PBS清洗细胞 一次，弃掉上清 将 细胞沉淀

放置到 -70到 -80度冰箱冷冻 10min。用 550ul缓冲液 A重悬细胞沉淀。涡旋振荡 20-30s，迅速转移

至离心管柱上 转接步骤 2.

b) 组织样品， 将 30-40mg冷冻 组织 样品（ 新鲜组织 至少 需要在 -20或者 -80冰箱 冷 冻过夜 放置于离

心管柱上，加 200ul缓冲液 A，用塑料棒 反复扭转按压 研磨 2-3分钟。再加 入 350ul缓冲液 A到离心

柱 用移液器 上下 吹打 混匀 。 转接步骤 注： 研磨棒 塑料棒可重复使用，用 75%酒精擦拭或用蒸

馏水冲洗干净。

2. 盖上盖子， 上下颠倒混匀几次， ，16000X g离心 30s。 （此步骤需离心机快速升速 10S内到达 16000Xg可

提高得率） ）（可选优化：细胞样品 过柱之后，可以 再次重悬细胞，转移回同个离心管柱中 再次过柱，可以

增加产量）

3. 弃去离心管柱， 涡旋大力重悬沉淀 10S 2000X g离心 5min，，（沉淀中包含细胞核 ，大的细胞碎片和 一些

未破裂的细胞）

4. 将 上清转移至一个新的 1.5ml离心 管中 （尽量避免吸取到油脂 8000X g 4℃离心10min。离心完毕，小心的吸取400ul上清转移至一个新的1.5ml离心 管中（尽量避免吸取到油脂 。离心所得沉淀主要是大的细胞碎片，线粒体，溶酶体和细胞质膜。

5. 将40 ul缓冲液B添加到400μl上清液的离心 管中。涡流震荡混匀(缓冲液B与上清的比例为1:10)。在4度，孵育20-30min。

6. 8000X g， 4℃离心10min，完全弃去上清。用400ul预冷的缓冲液A吹打40-50次重悬沉淀，涡悬振荡20s（此步沉淀有很多以透明状态附着于管壁，需用移液器吹打管壁，将沉淀全部吹散，涡旋振荡至肉眼不可见颗粒沉淀为止）。在重悬液中加入40ul的缓冲液C(按照重悬的体积1/10体积 涡旋 振荡混匀，

室温孵育 10-15min，每 5min涡旋 振荡一次 （延长孵育时间 到 30分钟 有助于增加内质网得率） 。 8000X g离心

5min 将 400ul上清转移到一个新的 1.5ml的 离心 管中。再加入 400ul缓冲液 D(按照上清液体积和

缓冲液体积 1: 4度孵育 20min。 注：缓冲液 D需恢复室温，摇匀再使用 。

7. 10000X g离心 10min，弃去上清液。再次 10000X g离心几秒钟，甩掉管壁残留的液体，将残液完全去

除。

沉淀是内质网

，主要是粗面内质网。 内质网 含量在不同类型的细胞 /组织中有显著差异 ，通常得率为 20-200ug/样品。非水溶性的内质网沉淀，可根据下游实验用 50-200ul溶解液重悬沉淀（见下表格）。 如果不

及时使用 样品 ，请 在溶解液中 添加蛋白酶抑制剂 ，将样品冻存于 - 80℃）。