细胞免疫荧光protocol最全

一、什么是免疫荧光？

免疫荧光（Immunofluorescence，IF）

简单来说就是抗原抗体反应，我们的目标蛋白（抗原）和特异性抗体（一抗）结合形成抗原抗体复合物，携带荧光素标记的抗体（二抗）再和复合物结合，荧光素可以被激发而产生特定荧光，促使我们定位到我们的目标蛋白，相同原理的实验技术还有WB，这么一说是不是就懂了~

二、免疫荧光怎么做？

虽然原理和WB相同但实验方案还是有很大出入滴~

免疫荧光主要是对组织或细胞内特定抗原进行定位和定性分析。

划重点：细胞虽死，但一切停留在一瞬间，保留了形态和定位，怎么做到我们下面就说~

祖传珍藏IF protocol（以细胞为例）~

准备操作：

（1）确保干净的细胞爬片（一般直径14mm，24孔板专用，注意：平时可以泡在75%乙醇里，用的时候过PBS，保证清洁即可）

（2）生长状态良好的细胞，铺板于24孔板中，推荐复孔个数3个，接种密度要根据细胞生长速度来定，一般5X10⁴/well。

铺板要点：一般来说，24孔板每孔培养基需要500微升，为了保证细胞平均分布于爬片上，可以将爬片置于孔内后，先将细胞悬液100微升滴加至爬片上，此时表面张力将细胞牢牢圈定在爬片上，保证细胞不向孔边缘聚集，将孔板置于培养箱30min后补加400微升完全培养基，将孔板放回培养箱继续培养24小时。

正式操作：

（1）洗涤：将孔板取出，弃去培养基，在细胞上缓慢加入常温PBS，清洗2次；

敲黑板：此时操作应该在细胞间外，PBS一般配置后高压灭菌即可，使用前最好保证PBS为37度，和细胞一致，保证细胞状态稳定。

（2）固定：室温下，在 4% 多聚甲醛（溶于 PBS 中，pH 7.4）中孵育细胞 10 分钟，推荐用量：200微升/well，温度最好37度。

敲黑板：一般情况下选择甲醛作为固定剂，用于固定蛋白。

常识补充：

醛类固定剂会与细胞蛋白发生反应和交联，从而固化样品，并使之变得稳定。且能穿透质膜并固定可溶性蛋白，但某些靶标可能会在醛交联中丢失自身的抗原性，所以可能会用到抗原修复（极少数）。

醇类固定剂是甲醇和乙醇，甲醇和乙醇的分子结构与水非常相似，因此，它们可以与水竞争蛋白质氢键，取代组织中的水分子从而起到固定作用，但醇类的渗透性不如甲醛好，主要用于固定冷冻组织切片和细胞。因此，醇类固定剂更适合膜表面抗原。

（3）洗涤：去除固定液，使用4℃预冷的PBS缓冲液，漂洗3次，每次5分钟，水平摇床60-80rpm。

敲黑板：预冷是为了防止固定后的细胞从爬片上脱落~

➤Tips

甲醛有毒性，加固定液和固定后的清洗需在通风橱内操作。

（4）通透： 用 0. 5% Triton X-100或 100 μM Digitonin 或 0.5% Saponin（PBS配置）室温孵育细胞 10 分钟，推荐用量：200微升/well。

敲黑板：Triton X-100 是用于破膜（与磷脂作用）提高抗体渗透性最常用的去垢剂。但 Triton X-100 会破坏细胞膜，因此不适用于细胞膜抗原。事实上最好进行预实验确定每种目标蛋白的 Triton X-100 最佳比例。这一步如果是膜蛋白甚至胞质蛋白基本可以不做。

（5）洗涤：去除通透液，使用PBS缓冲液，漂洗3次，每次5分钟，水平摇床60-80rpm。

（6）封闭：用 5% BSA或来源于产生二抗的物种的5% 血清( PBS配置) 37度孵育细胞 30 分钟，以封闭抗体的非特异性结合，推荐用量：200微升/well。

敲黑板：在此期间，可以用封闭液按照抗体说明书的推荐比例稀释一抗和二抗，一般为1:50-1:500,稀释好的抗体保存至-20度。

（7）一抗孵育：去除封闭液后，室温下，用稀释抗体在孔板中孵育细胞 1 小时，或 4 ℃ 过夜孵育，推荐用量：200微升/well。

敲黑板:一抗可以回收反复使用，至于用到什么时候。。用到不能用为止，勤俭是美德~

（8）洗涤：去除一抗，使用PBS缓冲液，漂洗3次，每次5分钟，水平摇床60-80rpm。

（9）二抗孵育：室温下，用稀释抗体避光（二抗标记了荧光素）孵育细胞 1 小时。

敲黑板：这一步开始都要避光哦!

（10）洗涤：去除二抗，使用PBS缓冲液，漂洗3次，每次5分钟，水平摇床60-80rpm。

（11）复染：用 0.1-1 μg/mL Hoechst 或 DAPI工作液（DNA 染色，用于标记细胞核位置）室温避光孵育细胞 10 分钟。

（12）洗涤：使用PBS缓冲液，漂洗3次，每次5分钟，水平摇床60-80rpm。

（13）封片：在载玻片上滴加20微升抗荧光淬灭剂后将爬片取出倒扣于其上，细胞面朝下，用指甲油密封盖玻片边缘，避免样品变干和在显微镜下移动。