聊下细胞刺激方法

一. 凋亡刺激

在实验中，星孢菌素(Staurosporine)刺激和紫外线（UV）刺激是诱导细胞凋亡最常用的两种方法。而Caspase蛋白家族则是细胞凋亡过程中最关键的蛋白之一，为此可以Caspase蛋白的变化间接反应细胞凋亡的情况。

1) 星孢菌素刺激Jurkat 细胞

实验方法：以Jurkat细胞为实验对象，待细胞密度达到1.0X10⁶个/mL 时，加入星孢菌素终浓度1μM，刺激时间6h，按时间梯度取样，以 Caspase 3 抗体（Cat.No. 19677-1-AP，Proteintech）检测Caspase 3 蛋白水平的变化。

实验结果：星孢菌素刺激之后，随着刺激时间加长，全长Caspase 3 的蛋白水平不断下降；剪切体Caspase 3 的蛋白含量不断增加，间接反映了细胞凋亡的发生和加强。

2) 紫外线刺激HeLa 细胞

实验方法：以HeLa 细胞和为实验对象，待细胞汇合度达到90% 时，使用超净工作台紫外灯刺激细胞，刺激时间2h，对照组正常光照培养；以 Caspase 12 抗体检测Caspase 12 蛋白水平的变化。

实验结果：UV刺激之后，全长Caspase 12和其剪切体蛋白水平显著上升，间接反映了细胞凋亡的发生和加强。

二. 自噬刺激

饥饿胁迫 和雷帕霉素（Rapamycin）处理等可引起自噬（增强自噬小体形成）；氯喹或巴弗洛霉素A1等溶酶体抑制剂可以抑制自噬（抑制自噬小体和溶酶体结合）。LC3蛋白，尤其是脂化后的LC3-Ⅱ是自噬小体膜组分，可用于自噬小体标记，同时脂化后的LC3-Ⅱ和未脂化的LC3-Ⅰ二者含量的变化也可体现细胞自噬的水平。

1) 无血清培养HepG2 和HEK293 细胞

无血清培养所造成的营养缺失可诱导细胞出现自噬，形成自噬小体。低浓度氯喹可以改变溶酶体的pH值，阻止自噬小体和溶酶体的结合，从而使自噬小体处于可观察状态。

实验方法： 实验组HEK293 和HepG2 无血清培养2 h 后换新鲜培养基，加入终浓度为50 μM 的氯喹培养24 h；  对照组 HEK293 和HepG2 无血清培养2 h 后换新鲜培养基，24 h 后同实验组一起收细胞。 刺激完成后以LC3 抗体通过免疫荧光（IF）实验直接观测自噬小体的数目或WB 实验检测LC3-Ⅱ 和LC3-Ⅰ 的蛋白水平。

实验结果： IF实验显示氯喹处理的细胞中LC3蛋白由未处理时的均匀而弥散分布 转变成 聚集的环形和点状亮斑结构（自噬小体）；同时WB实验显示氯喹处理后细胞脂化的LC3-Ⅱ含量升高；两个实验均表明处理之后自噬水平大大提高。

2) 雷帕霉素刺激293T 细胞

雷帕霉素作为经典的自噬诱导剂可通过抑制mTOR信号通路进而增强自噬的发生。

实验方法： 刺激前24 h 铺细胞，在细胞汇合度70%-90%开始刺激，加入终浓度分别为为20 nM、100 nM、500 nM 的雷帕霉素刺激293T ，同时还可设置时间梯度0h，6h，18h，24h；另设对照实验，即可同上实验，以LC3 蛋白通过IF 或者WB 监测细胞自噬的发生和变化。

3) 羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）增强线粒体自噬

羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）作为一种氧化磷酸化解偶联剂能抑制线粒体电子传递链，影响线粒体蛋白合成。CCCP可以促进PINK1蛋白的表达，PINK1蛋白进一步刺激泛素分子的65位丝氨酸磷酸化，募集并激活parkin，进而诱导线粒体自噬。

实验方法：刺激前24 h 铺细胞，细胞汇合度70%-90%开始刺激，使用终浓度为10 μM CCCP 刺激24 h，设置好对照 (CCCP 以DMSO 稀释，母液浓度10mM) 。以 Phospho-Ubiquitin(Ser65) 抗体WB 实验检测65 位丝氨酸磷酸化的泛素分子的蛋白水平。

实验结果：CCCP刺激之后，泛素的65位丝氨酸磷酸化水平显著上升，表明线粒体自噬水平增强。

三. 细胞周期

G0期，G1期，S期，G2期和M期等是细胞周期的5个阶段，调控着细胞的生长、分裂。细胞周期的调控刺激，掌控着细胞的命运。

1）Nocodazole 刺激 HeLa 细胞

实验方法：Nocodazole 是常用的细胞中期阻断剂，可以将细胞周期阻断在M 期，使得细胞周期同步。 实验时 加入终浓度为1 μg/ml Nocodazole 到汇合度为70% 左右 的 HeLa 细胞，分别培养48 h、24 h、16 h 后收细胞，对照组不刺激。

B）BrdU 刺激 HeLa 细胞

溴脱氧尿苷（BrdU）是一种合成核苷，类似于胸腺嘧啶。它可以被合并到新合成的复制细胞的DNA(在S期，DNA复制过程中取代胸苷）。因此，BrdU 被用于测定出生日期和监测细胞增殖。

实验方法：在HeLa 细胞中加入工作浓度为0.03 mg/ml 的 BrdU，37℃培养2 h，后收细胞固定，2 M HCl 处理30 min， 对照组不刺激。通过IF 实验以 BrdU 抗体检测 BrdU 的插入情况。

实验结果：BrdU 聚集在细胞核中，标记正在增殖的细胞。

2） CaCl 2刺激 EC109 细胞

实验方法：刺激前24h铺细胞，刺激时细胞汇合度70%-90%，加入终浓度为0.06 mM及1.8 mM CaCl 2  培养基分别培养0 d、3 d、5 d、7 d、10 d 收细胞，随后通过WB 实验和IF 实验检测ZNF750。

3）胰岛素刺激HeLa 细胞

实验方法：胰岛素可通过 mTOR 信号通路调控细胞周期和细胞增殖。 故以胰岛素刺激细胞同样会引起细胞周期的相关变化。 刺激前24h铺细胞，刺激时细胞汇合度70%-90%，加入终浓度为100nM胰岛素刺激15min后收细胞，设置无刺激对照。

四. 氧含量刺激

 氧气是维持细胞和生物体活动所需能量来源的重要物质基础，也是机体新陈代谢启动机制的关键之一。低氧环境可以增强呼吸强度，抑制生理运作；过氧化环境则会促进衰老。

1) 低氧刺激

实验方法：CoCl₂是一种化学性低氧模拟剂，在多种培养细胞中能模拟低氧状况。实验前24 h 铺细胞，待细胞汇合度70%-90% 时开始刺激。使用终浓度为250 μM、400 μM 的CoCl₂ 溶液分别刺激6 h，对照组不加CoCl₂ 。HIF1a 是细胞对缺氧反应的主要调节因子，在缺氧条件下蛋白水平会显著变化，并且亚细胞定位也会改变，可作为低氧刺激检测指标。

实验结果：在CoCl₂ 处理之下， 以 HIF1a 抗体检测 HIF1a，结果表明HIF1a 的蛋白水平显著上升，同时亚细胞定位由胞质向核内转移，表明细胞对低氧刺激有明显响应。

2）过氧刺激

实验方法：以HeLa 细胞和HEK293 细胞为实验对象；使用利尿酸（ethacrynic acid，EA）刺激细胞产生胁迫。刺激前24h铺细胞，细胞汇合度到70%-90% 开始刺激，加入终浓度为100 μM EA 刺激5 h 后收样，设置无刺激对照。 TDP43 蛋白的磷酸化 是很多神经退行性疾病的一个指标，同时它也是细胞响应过氧应激的一个重要角色。

实验结果： EA 刺激之后，以TDP-43抗体检测TDP43 ，结果显示TDP-43 蛋白被磷酸化（50 kDa），并被剪切成TDP35 的磷酸化片段（35 kDa），表明细胞正在响应EA 给细胞造成的刺激。

五. 炎症刺激

炎症是机体对于刺激的一种防御反应。细菌、病毒、真菌、寄生虫等生物因子，酸、碱、坏死组织的分解产物等化学性因子，高温、低温、放射线物质、紫外线和机械损伤等物理因子都可以导致炎症反应。

在实验中，我们常以下面几种化合物或者化合物组合来刺激细胞建立炎症模型。在炎症发生之后，细胞中的PD-L1 蛋白和IDO1 蛋白的水平会发生明显变化，二者可作为炎症检测靶标。

1）PMA 刺激 Jurkat 细胞

实验方法：Jurkat 细胞密度1.0 x 10⁶ 个/mL，实验组加入终浓度为10 ng/ml PMA 培养2 h（PMA 母液以DMSO 配制），对照组加入等体积DMSO，2 h 后收细胞制备裂解液。

2）LPS 刺激 HepG2 / U937 / THP-1 细胞

实验方法：刺激前24 h 铺细胞，刺激时细胞汇合度70%-90%，实验组使用终浓度为0.1 μg/ml LPS 刺激18-24 h，设置无刺激对照。

3）TNF-α 刺激 HUVEC 细胞

实验方法：刺激前24 h 铺细胞，刺激时细胞汇合度70%-90%，实验组使用终浓度为10 ng/ml 刺激18 h，设置无刺激对照。

4）PHA+LPS 共刺激

实验方法：细胞密度0.5x10⁶个/ml，6孔板每孔细胞总量1 x 10⁶个，PHA终浓度10 μg/ml ，LPS终浓度 50 ng/ml ；刺激时间分别为：PHA 30min+LPS 10min；PHA 1h +LPS 30min； PHA 1d + LPS 2h；PHA 2d +LPS 1d；PHA 3d +LPS 2d。

实验结果：以LPS 刺激 HepG2 / U937 / THP-1 细胞为例，在刺激之后，细胞中的PD-L1 和IDO1 的蛋白水平显著上升，表明细胞正在发生炎症反应。