关于养细胞时黑胶虫污染的一些心得【巨详细，手把手教你拯救细胞！】

一般来说，黑胶虫污染的话可以在高倍镜下看到震动的小黑点，是来回震动，不过我们实验室显微镜看不清，而且这种方法好费眼睛👀多的情况下倒是好找，少的话我是真的达咩

一、判断细胞是否被黑胶虫污染：

1⃣️高倍镜下仔细观察【细胞膜】：

被黑胶虫污染的细胞，其细胞膜会变得模糊不清，边界不清，有种很粗糙的感觉！！！（见图1、2）（正常细胞膜是非常清晰锐利的，见图5、6哈），刚开始你可以看到细胞膜变模糊很粗糙，有时细胞膜上会粘上小黑点（就是粘这种感觉），最糟糕的情况就是细胞整个都模糊了根本看不清结构

2⃣️【黑色杂质】：

培养液清澈不浑浊，但是培养液里面有很多黑色杂质，瓶底贴壁也会沉着黑色杂质，这种黑色杂质不管怎么冲都冲不干净，

那种像小黑点的黑色杂质有时候在高倍镜下可以看到震动，这种就很直观说明黑胶虫污染，但我遇到的更多情况是这些黑色杂质看着就一直不动。

🉑️通过消化下来低速离心去除一部分黑色杂质（不过此方法治标不治本）

3⃣️【增殖速度变慢】：

我的细胞一般一传二传代下来第3天密度就80～100%，所以如果第5天都还没有长到80%左右，我就会考虑出问题了

（不过我自从有过污染经历之后，每次都会关注高倍镜下细胞膜，我感觉有时候被黑胶虫污染之后你可能传一代下来还看不出增殖速度减慢了，但是往往细胞膜变得模糊有那种粗糙的感觉这种征象会出现的更早）

图1

图2

（红色圈圈是比较明显的污染的细胞，绿圈都是黑色杂质，不过图2黑色杂质还很少）

图3

图3这种能不能救回来不好说，纯纯看运气，你看这些细胞很多都失去了原来的形态，表现为体积变大、融合成片、成团

图4

图4这个估计是救不回来了，可以考虑扔了，不然浪费培养液

👇👇👇下面放正常状态很棒的细胞图片哈（记得和上面的图对比，非常明显的区别）

图5:正常状态的细胞

【给我放大仔细看细胞膜，边界真的都非常的清楚锐利，培养液也非常干净】

图6:正常状态的细胞

【同样也是细胞膜边界清楚锐利，培养液干净】

二、拯救被污染的细胞🙌🙌🙌

✴️✴️✴️我最推荐的就是用【黑胶虫清除剂】✅✅✅哈，当然如果你的课题组之前冻存的细胞多或者没那么珍贵，可以选择污染了就扔重新复苏新细胞哈

我用的那款黑胶虫清除剂感觉价格还能接受（一支1ml，200r出头），所以我那会儿污染的时候就都用黑胶虫清除剂来救细胞了，不过也不敢买多了，一次最多买3支以内，也可以用好久了，完全可以救回来十多二十瓶细胞了。

❇️说下用法吧

1⃣️说明书说的是10ml完全培养液里面加50微升的黑胶虫清除剂，因为我当时养了很多瓶细胞，大概有8～10瓶污染了，所以我每次都是直接配一个粗离心管的量（50ml完全培养液➕250微升黑胶虫清除剂）配一管够换一次液了，可能还会剩个10多ml，虽然说明书说现配现用，但价格贵我还是留下来了反正下次换液也就2天后

2⃣️换液频率：

我用的是T25培养瓶哈，所以平时一般我换液都是➕5ml的完全培养液，然后2天换一次液；

但是我现在加了黑胶虫清除剂了，我一般刚开始第1、2次换液，每次加5ml有黑胶虫清除剂的完全培养液➕1～2ml没有黑胶虫清除剂的培养液，然后第3、4次换液的时候就加3ml有黑胶虫清除剂的培养液➕2～3ml没有黑胶虫清除剂的培养液（因为一般第1、2次换液后情况就有好转了，一般第3次换液后，等第4次换液前去观察细胞差不多都在变好了）

不管是第1、2次换液还是第3、4次换液，我的换液频率都改成了3天换一次（比如1号早上换液，下次换液就是在4号早上），这就是我上面还多加了点无黑胶虫清除剂的完全培养液的原因，换液频率延长了稍微多加点培养液免得营养不够，如果换得太勤了也有点浪费清除剂

3⃣️好转征象：

刚开始第1、2次换液前你去镜下看会发现培养液里面漂的黑色杂质还是一样多甚至更多，还漂着死细胞。👉这个时候不要放弃！你仔细观察会发现黑色杂质虽然漂的很多，但是之前沉淀在瓶底的黑色杂质基本都漂起来了，瓶底会变干净许多，而且漂起来的细胞都是那种被黑胶虫污染无可救药的，剩下的贴壁的都是还有机会挽救的细胞

等到第3、4或者第4、5次换液的时候，首先整个瓶底黑色杂质很少了，培养液里面黑色杂质也少了很多，最令人开心的征象就是400倍镜下看细胞膜，不再像原来一样模糊不清了，反而渐渐开始变得清晰锐利起来，这就说明你救的很好了，个人感觉差不多黑胶虫清除剂换5、6次液之后，就可以换回原来无清除剂的完培了

❇️细胞逐渐好转的图给大家看一看哈：

图7

图7:这个是黑色杂质已经清楚的很少了的状态了，可以看到还有一点点杂质，但细胞膜已经变得比较清楚锐利了，这瓶应该是我救的比较早，所以最后救回来的时候还存活了很多细胞

图8

图9

图8、9:这个就非常明显了吧，首先背景干净，没什么黑色杂质了，细胞也很漂亮该清晰的清晰，这两瓶救回来的数量不多不少吧，完全能重新长起来

图10

图10:这个救回来的数量算少了，不过这个密度其实最后也能长起来的，就是时间稍微久一点可能长到40～50%%左右要个接近一周，长到40%左右就可以消化下来重新铺一遍铺均匀了，重铺之后会长得很快

图11

图11:这个是我救回来的细胞长满了哈哈100%

最后，污染真的漫长又痛苦，希望大家看完能有一些收获，实验顺顺利利！