总结一份western blot （WB）的protocol
RUNNING
1、制SDS-PAGE胶
1）取1.5mm玻璃板，注意下缘无明显破损；
2）洗玻璃板：用洗洁精+软刷清洗玻璃板两侧，dd H2O 冲洗玻璃板两侧，再用无水乙醇冲洗两侧，桌子上垫卫生纸，将玻璃板立于纸上，靠在枪头盒旁，晾干；
3）将玻璃板对好，放入玻璃板夹中，平放于试验台上，向下按压几次，保证底部平齐，夹上玻璃板夹，查看底部是否对齐。完毕后放入胶板架子上；
4）配制分离胶：按配制表格配制各组分，注意10%AP容易失效，必要时新鲜配制，否则容易引起胶不凝固；
5）用1ml枪头将分离胶加入胶板，上缘至蓝色线附近，15ml管中剩下的胶勿扔，可以用来看胶是否凝固；
6）分离胶上用异丙醇压胶；
7）等待20分钟左右，此时可以配制RUNNING液，按表格配制，旋转混匀待用；
8）胶凝固后，倒出异丙醇，用 ddH2O 轻轻冲洗分离胶上方，用干净滤纸吸干，注意勿碰到分离胶，倒置胶板，让剩余的水流出。
9）配制浓缩胶：按配制表格配制各组分，tris 的ph 和分离胶不同，注意10%AP容易失效，必要时新鲜配制，否则容易引起胶不凝固；
10）用1ml枪头将浓缩胶加入胶板上缘探出玻璃板，插入1.5mm梳子，插入时注意用卫生纸挡住，以免溅出到皮肤，勿留气泡，等待凝固；
2、凝固后，将玻璃板取下，卡入电泳槽架，如只跑一块胶，用另一个塑料板对称放入，稍向上提，夹住；
3、放入电泳槽后，向两胶板之间倒入电泳液，至最上缘，垂直向上拔出梳子；
4、用2ml注射器冲洗泳道；
5、加样：每泳道15ul-20ul，marker孔加4ul marker，用1*loading补齐，样品孔加10ul-15ul样品，1*loading补齐，其余每孔加1*loading补齐，每孔总体积相同；
6、加入剩余的电泳液，插上电源，注意正负极不要弄反，80v电泳至分离胶附近，或看到marker开始分出条带，改为120v继续电泳约1h，至loading跑出分离胶。
TRANS
7、电泳时配制转膜液，配制好后，放入冰中预冷；
8、取一个可以放转膜液的盒子，倒入冷转模液，平放转膜夹，黑近，白远，黑色上铺一层海绵，3层滤纸，浸湿，勿留气泡；
9、将胶板取下，撬开两层玻璃板，小心切胶，去处不用的部分，可在marker一边斜上方切一角标记；
10、将胶小心放入滤纸上，滚轮轻压，勿留气泡；
11、剪相应大小的NC膜，手勿接触膜，放入胶上，滚轮轻压，勿留气泡，其上放3层滤纸，1层海绵，滚轮轻压，合上转膜夹；
12、如转模滤纸太大，剪刀减去漏出部分，以防短路；
13、放入转膜槽，注意正负极，倒入转模液，槽中放冰袋一枚，将转膜槽放入盛满冰的盆中；
14、接通电源，注意正负极，150mA转膜2h。
孵育一抗
15、取洁净15ml离心管，1:1000稀释一抗（5ul一抗+5mlTBST）
16、转膜结束后，找洁净6cm或10cm培养皿一只，镊子取出NC膜，置于皿中，与膜接触的面向上，加入 TBST 5ml 摇床清洗5min；
17、配制5%的脱脂牛奶，（2.5g 脱脂牛奶+50ml TBST）；
18、倒出TBST，加入脱脂牛奶常温摇床封闭1h；
19、倒出牛奶，TBST摇床清洗3次，每次5min；
20、倒出TBST，加入一抗，4℃摇床孵育过夜；
孵育二抗
21、用1ml枪头回收一抗（回收，加入叠氮钠1:1000, 4°或-20保存），TBST摇床清洗3次，每次5min；
22、配制二抗（按照一抗选择二抗），1:2000稀释（2.5ul二抗+5mlTBST）；
23、倒出TBST，加入二抗，室温摇床孵育1h；
24、倒出二抗，TBST摇床清洗3次，每次5min；
显影
25、提前打开显影仪，降温至4°；
26、取避光1.5ml离心管，取500ul A + 500ul B 显色液，混匀；
27、取洁净培养皿一只，滴几滴显色液，将NC膜贴于其上，在NC膜上均匀滴上显色液，放入显影仪显影。
strip
28、配制酸性strip 溶液 Mild stripping
1）按1 L体积配制，加入如下组分：
15 g glycine
1 g SDS
10 mL Tween 20
溶解于800ml dd水中
调节 pH 至 2.2
用dd 水补齐至1L
29、将NC膜放在洁净培养皿中，加入上述strip液体，没过膜，室温摇床孵育5-10min；
30、弃去液体，重复29一次；
31、弃去液体，PBS 洗10min，2遍；
32、弃去液体，TBST洗5min，2遍；
33、重复步骤17，继续封闭
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 4018
