WB β-actin的一些实验经验

经历了一个多月接近两个月的挣扎，可算是把WB的蛋白结果做出来了（个人觉得还蛮好看的），为了3张图，包括从前期养细胞提取蛋白什么的，整整花了快3个多月……实在太不容易了

为此，我把个人的一些小经验总结下，看看其他战友们有没有类似情况的，说不定会帮得上忙

1.先来张我第一次做内参的图……一个词（惨不忍睹）

再对比下我小伙伴做的，差距，实在是太大了……我酸了（他说这是教科书式actin,我觉得确实如此，实在太好看了，整整齐齐一条带 很干净）

2.不过好在！经过小编的一番咨询实验室的师兄师姐以及小伙伴WB专家，可算是解决了膜“黑乎乎”不干净的问题了

那就是 1.二抗后没有洗膜，这是最最主要的问题所在（因为师姐给的流程里没有洗膜这一步……得怪我自己没有好好思考）按照我小伙伴的一句话就是“二抗是加强显色的，你不洗那就是终极加强”，所以从这次以后洗3次，每次15min

2.显色液加太多了……怪我没经验…（不过这是次要问题，在之后的实验我试过了。因为洗膜干净的话 加多了显色液其实影响并不大）

好了！本来以为可以开心一下了！想不到旧的问题解决了，新的问题又出现了！！！

每次都是两个条带……反复7次7天都是都是如此！

实在太痛苦了，以至于我都已经准备要放弃了……

还好我不甘心，坚持重新提取蛋白做第8次，第9次，第10次……越做越好看

还是有浅浅的其他条带，但是对于做了一个星期都是很丑的图的我已经超级无敌开心了！！

这是近期做出来的，虽然跟小伙伴还是有点点差距，但是对于我来说已经是很好好看了！

在无数失败到成功过程中我得到了以下几点经验

1.出现多条带，是蛋白降解了，后面我考虑在提取蛋白时侯加多了些蛋白酶抑制剂，加长10min让细胞充分裂解。果然条带好看了！这点真的超级重要！还有提取蛋白后要尽快加loading Buffer让蛋白变性，低温保存。不然又会有些降解的。

2.其实一开始图也不是特别干净，还有其他杂带，所以我考虑是不是封闭的问题，之前都是封闭后洗膜，每次15min.而后来我就改变了方法，封闭后洗1次膜，1min(为了保持一抗干净），然后直接加一抗过夜。从这以后，不管做内参还是做其他蛋白，膜都是很干净的。

（这时候想起来之前在帖子有老前辈说到一句话，印象很深刻：不要害怕实验出错，出了错才能让你更好地关注细节，而细节恰恰是决定成败的关键！）

然后

自从这个内参做好了，后面再做其他蛋白，都算是比较成功的，没有因为一些细节而失败的。想起来二哥说的：先苦后甜！哈哈哈哈深有体会！

不知道我有没有什么地方是说的不对，或者理解错误的。欢迎小伙伴们指出我的错误呀~

对了，我的大致流程是这样子的

1.养细胞 给药   加蛋白酶抑制剂和细胞裂解液裂解细胞

2.提取蛋白变性 跑电泳。（浓缩可以久一点）

3.转膜 4.脱脂奶粉封闭90min  5.直接加一抗，4℃孵育过夜      6.TBST洗膜3次，每次15min

7.加二抗，30min      8.洗膜3次，每次15min

9.显色

好啦~我去复习看书啦~

考研党

回复消息很慢，望小伙们谅解喔~