【求助】pLKO慢病毒载体EcoR1和AgeI双酶切，跑胶拖带
这个帖子发布于 11 年零 327 天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
本人最近在做慢病毒载体的构建，双酶切pLKO载体，NEB的酶，酶切体系：
pLKO 2ug
EcoR1-HF 1ul
AgeI-HF 1ul
Smart buffer (buffer 4+BSA)
H2O 补充至50ul体系
37度酶切1h，也酶切过3h，和过夜酶切，也尝试过先AgeI酶切过夜，第二天早上在加入EcoR1酶切1h
0.8%-1%电泳回收
切胶的时候总是看到拖带，拖得很严重。其中一次不得已，只能电泳五十分钟，使拖带与目的条带尽量分开，之后切胶回收，做连接转化，不长。
为了验证是否切开，我将回收的pLKO骨架与一条无关的含有双酶切位点的片段（1.2k）试连接，结果都不长。
求助什么情况…刚才看完论坛里的相关帖子，是否跟我酶切之后没有灭活有关？
第一张图是质粒，单双酶切的检测图，应该是能切开的，质粒也没错。
第二张图是某一次还算可以的酶切后准备切胶的图，酶切也还行，但是有拖带，回收回来的骨架连不进退火的寡核苷酸链。然后连了一个前面说的1.2k的片段，都不长。
第三张图是总是出现的拖带。很无语。
pLKO 2ug
EcoR1-HF 1ul
AgeI-HF 1ul
Smart buffer (buffer 4+BSA)
H2O 补充至50ul体系
37度酶切1h，也酶切过3h，和过夜酶切，也尝试过先AgeI酶切过夜，第二天早上在加入EcoR1酶切1h
0.8%-1%电泳回收
切胶的时候总是看到拖带，拖得很严重。其中一次不得已，只能电泳五十分钟，使拖带与目的条带尽量分开，之后切胶回收，做连接转化，不长。
为了验证是否切开，我将回收的pLKO骨架与一条无关的含有双酶切位点的片段（1.2k）试连接，结果都不长。
求助什么情况…刚才看完论坛里的相关帖子，是否跟我酶切之后没有灭活有关？
第一张图是质粒，单双酶切的检测图，应该是能切开的，质粒也没错。
第二张图是某一次还算可以的酶切后准备切胶的图，酶切也还行，但是有拖带，回收回来的骨架连不进退火的寡核苷酸链。然后连了一个前面说的1.2k的片段，都不长。
第三张图是总是出现的拖带。很无语。
