“应知应会”双荧光素酶报告系统原理与实验操作

1 背景知识介绍

1.1 双荧光素酶报告系统

双荧光素酶报告系统（dual luciferase reporter）：萤火虫荧光素酶（Firefly luciferases）和海肾荧光素酶（Renilla luciferases），由于其不同的进化起源，具有不同的酶结构和底物需求。

1.2 萤火虫荧光

1.2.1 萤火虫荧光反应

萤火虫荧光素酶是一种61kDa的单体蛋白，不需要翻译后加工就能产生酶活性, 因此，它在翻译后立即发挥遗传报告基因的作用。萤火虫荧光素酶光发射（Photon emission）需要重组萤火虫荧光素酶、氧气、ATP和Mg2+同时存在才能发光，发光颜色为黄色[1-2]，反应如图1所示。

（图1 萤火虫荧光素酶参与反应）

1.2.2 萤火虫荧光应用

萤火虫荧光素酶：一般是作为告基因(启动子 5’UTR/非编码RNA，例如miRNA (3’UTR)，lncRNA (intergenic)，ceRNA等) 的载体，将目的基因构建在该载体上，从而反应目的序列调控活性的作用结果，因此根据实验目的，可以针对此质粒进行改造，构建重组质粒用于验证序列，载体的工作原理如下图所示（以启动子和miRNA举例） [3]：

（图2 报告基因系统工作及检测原理示意图）

1.3 海肾荧光素酶

1.3.1 海肾荧光素酶反应

海肾荧光素酶（Renilla luciferase）是一种36kDa的单体蛋白，从其天然来源海肾（Renilla reniformis）中纯化后，含有3%的碳水化合物组成[4]。然而，与萤火虫荧光素酶一样，其活性不需要翻译后修饰，该酶可能在翻译后立即发挥遗传报告基因的作用。海肾荧光素酶催化的发光反应利用O₂和腔肠荧光素酶。

（图3 海肾荧光素酶参与反应）

1.3.2 海肾荧光素酶应用

海肾荧光素酶（Renilla luciferase）通常作为报告基因的内参，用于报告基因的归一化处理。在实验实践操作过程中，通常会遇到各种误差误差，例如细胞数目不均一、构建的质粒质量差异、细胞状态不统一、转染效率不一致等因素。引入海肾荧光素酶收集的荧光数据作为去归一化报告基因，以此来相对定性检测报告基因的测量结果，从而达到有效地减少实验误差的目的，海肾荧光素酶载体的工作原理如下图所示：

（图4 海肾荧光素酶的反应及信号检测）

2 双荧光素酶报告系统实验流程

2.1 双荧光素酶报告系统实验流程图

总体上来说，双荧光素酶报告系统实验只有四步，即1，构建重组报告基因质粒；2，工具/目的细胞铺板；3，荧光数据收集；4，数据统计分析。根据实验经验，最难做的是1，构建重组报告基因质粒。因此，为了更好的实验目的基因序列的扩增，一定要准备质量较高的模版（例如DNA，浓度，纯度，降解等都需要考虑进去）。

（图5  双荧光素酶报告系统实验流程图）

2.2 构建pGL3-Basic+基因重组质粒

双荧光素酶报告系统首先是构建报告基因系统，传统的是需要两个质粒，分别是报告基因重组荧光质粒（常见的是pGL3-Basic）和海肾荧光报告质粒（常见的是pRL-TK）。实验过程中，实验人员需要将自己感兴趣的基因片段（例如启动子 5’UTR/非编码RNA，例如miRNA (3’UTR)，lncRNA (intergenic)，ceRNA等）构建到pGL3-Basic中，得到含有目的基因的重组质粒。值得注意：在实验过程中需要用到优质的DNA片段，对于DNA的提取，请参考本公众号的推文《真核生物组织/体细胞与精子中DNA的提取-全方位知识囊括及实验操作》，把提取DNA的基本原理弄明白，有利于后续实验。海肾荧光报告质粒（pRL-TK）不做任何处理，只需要将pRL-TK与报告基因的重组质粒一起转染到工具细胞（例如293细胞）中即可。

（图6 pGL3-Basic质粒图谱用于构建重组质粒报告基因质粒）

（图7 海肾荧光素酶报告基因质粒图谱）

当然随着科技的进步，现在已经有公司将pGL3-Basic和pRL-TK两个质粒整合到一个质粒中（pmir-GLO，一般来说主要用于miRNA的研究），只要将感兴趣的片段插入构建重组质粒，即可完成双荧光检测，得到实验结果。

（图8 pmir-GLO质粒图谱）

2.3 细胞铺板与转染

细胞培养：细胞融合率达到 90%时进行传代培养，细胞铺板：取对数生长期的细胞制成细胞悬液，计数，接种于 24-well /96-well培养板中（细胞数量，根据细胞形态和生长能力大小而定），在铺板细胞细胞融合度达到约 50% - 60%，即可进行质粒转染工作（根据实验设计好实验组与对照组）。

2.4 荧光数据采集

在这里根据一般情况，描述实验步骤，具体步骤参考试剂盒说明书。

（a）取20 μL裂解液，加至培养板中。按照实验需要，可设置3孔-9孔重复，荧光数据一般不太稳定，建议多设计几个重复；

（b）配制萤火虫萤光素酶反应工作液和海肾萤光素酶反应液，即萤火虫萤光素酶底物（100 ×）和海肾萤光素酶底物（100×）。

（c）分别使用对应的缓冲液稀释至1×工作液，并孵育至室温。

（d）加入100 μL（具体参考说明书）萤火虫萤光素酶反应液，震板混匀，检测（波长550-570nm）萤火虫萤光素酶的活力，检测尽量在30 min内完成。

（f）加入100 μL（具体参考说明书）海肾萤光素酶反应液，震板混匀，检测海肾萤光素酶的活力，检测尽量在30 min内完成。

2.5 数据统计分析

将收集到的萤火虫荧光数值比上海肾荧光数值，即可得到感兴趣的报告基因的激活或抑制功能的定论。

3 常见问题及解决方案

3.1 启动子活性低（即萤火虫荧光数值/海肾荧光数值较小）

面对该问题主要考虑：1，细胞状态：优化细胞的培养条件，以及细胞状态进而提高荧光素酶的表达量；2，荧光信号衰减：荧光素酶的半衰期一般约30min，尽量避光条件下进行操作，且加完底物后立即检测，尽量在30min内完成数据采集。

关于荧光的问题-荧光值过高

3.2 荧光数值过高

荧光值过高可能会超出仪器检测范围，从而检测不到值，降低荧光值过高的问题主要通过以下方式尝试解决：1.减少质粒转染量；2.细胞样品裂解后，离心取上清后检测或对裂解产物进行稀释后检测；特别注意：不要延长检测时间，尽管数值降低，但是这是因为荧光素酶的半衰期到了，致使荧光数据降低，这样子的数值不能真是反应实验结果。

（爱自己！！！做科研!!! 每文格言诺贝尔文学奖得主加缪，47岁终年曾言：​不要走在我后面，因为我可能不会引路；不要走在我前面，因为我可能不会跟随；请走在我的身边，做我的朋友。如果有用，关注楼主GBhouse，点赞+讨论，攻击性人格请请请不要关注和阅读！！！）

参考：

[1] Synthesis of active firefly luciferase by in vitro translation of RNA obtained from adult lanterns

[2] Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli

[3] Bringing MicroRNAs to Light: Methods for MicroRNA Quantification and Visualization in Live Cells

[4] In: Bioluminescence and Chemiluminescence: Current Status, eds.