分子克隆技术-粘性末端篇（含酶切位点常见保护碱基表）

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粘性末端是指用限制酶将DNA双链切开露出不平齐的切口末端，与平末端相对。粘性末端克隆和平末端克隆一样都需要运用连接酶进行连接，才能将片段克隆到载体上，粘性末端存在立体卡位状态，需要有氢键和磷酸键共同维持所以相对稳定，另外需要两种相同的酶切割出来的粘性末端才能连接起来，因此其具有特异性。粘性末端克隆法有非常久的应用历史，发现者1978年获得诺贝尔奖，之后随着酶种类得到不断扩充和快切酶的出现，粘性末端克隆技术一度成为分子生物学最依赖的技术之一。本帖分两部分进行讲解：

一. 粘性末端克隆法引物设计：（口诀：一观二看三结合）

• 观察载体上能提供的酶切位点；
  
  如上图，观察启动子后的多酶切位点（为了照顾新同学，这里说一下，如图上载体有4个promoter，我们拿到载体要注意哪个是用于表达蛋白的promoter，CMV promoter是真核表达强启动子；T7是原核表达启动子；SV40真核启动子但后接了抗性基因；lac promoter是乳糖启动子），CMV 启动子是作为重组后目的基因的启动子，应该从其后找酶切位点（图上红框），分别选择两个载体上唯一的两个酶切位点做为双酶切位点，方便酶切割线并性化载体，这里选择HindIII和EcoRI；
• 看片段上含有的酶切位点，载体上选择的两个位点是否会在片段中间出现，如出现，则重新选择。这里以干性mark homo sox2基因为例；从KEGG中下载序列，粘贴到snapgene上，如下图，可以看出片段不含HindIII和EcoRI，所以可以将它们作为双酶切位点。（像下面的是短序列可以直接看，长序列在snapgene中运用查找功能）
  
  选择CDS前后20-23bp片段作为引物，先到NCBI进行blast,确定特异性较高之后，回到snapgene将引物标记出来，并添加酶切位点和保护碱基，至此完成了粘性末端克隆法的引物设计。
  
  
  
• 结合双酶切时两种酶体系的相容性、反应温度以及反应缓冲液相似性也是我们设计引物要考虑的事情，利用共性设计可以进减少操作步骤，提升实验成功率。

二.粘性末端克隆法实验操作（口诀：切接转增检）

• 将扩增出来的片段和载体进行酶切，载体酶切时间可设置比片段长一倍；
• 将酶切好的片段纯化后，用T4连接酶将片段和载体连接；
• 将重组载体转化到大肠杆菌感受态中；
• 热激后添加无抗性液体LB培养基使含重组载体的大肠杆菌增殖；
• 菌落PCR或者测序将正确的重组载体检测筛选出来；

粘性末端克隆实验操作很简单，主要的内容都在引物设计中，设计出特异性高、参数好、添加的酶切位点和保护碱基合理的引物，你就成功了80%。

 附酶切位点保护碱基