酶切法线性化|同源重组线性化的另一种方式

关于同源重组，我发了<教程：同源重组法载体引物设计（要素过多请反复学习） - 核酸基因技术 - 专业医生社区，医学、药学、生命科学、科研学术交流 (dxy.cn)>之后，有同学私信我，说这个比较难理解，酶切法线性化是不是也可以举例说明。酶切法确实简单、容易理解，但失去了随机性，没那么灵活。不过对于载体构建也是完全足够，特别是固定载体，酶切一次就可以做很久。废话不多说，教程都给出，你们去选择用什么方法。

酶切法线性化很容易理解，就是通过限制性内切酶将闭环载体切开，形成缺口，变成非闭环线性双链片段的过程，既可以是单酶切，也可以是双酶切，酶切之后可以与含有同源臂的片段重组，进行载体构建。

酶切法线性化重组片段引物设计：

---载体通过酶切线性化之后就没有必要设计引物通过PCR扩增线性化了，只需要将同源臂设计在片段引物上即可。

单酶切：

• 首先找到你要线性化的酶切位点，如下图我采用XbaI；

• 提请各位注意，这里直接弄了个比较复杂的例子，这是融合mCherry-Flag表达的载体，要注意两个基因之间的距离必须是3的倍数，并且去掉第一个基因的终止密码子。这里XbaI酶切位点后距离mCherry的ATG有6个碱基（3的倍数），所以下游重组区域可以从GCCACC开始。

• 可以将酶切位点前的15-20bp碱基接在片段上游引物中作为上游同源臂，将酶切位点后15-20bp碱基接在下游引物中，作为下游同源臂。（如图绿色部分）

• Forward：GACCTCCATAGAAGAT+片段上游引物
• Reverse：GCTCACCATGGTGGC+片段下游引物（注意都是5’-3’）

双酶切法引物设计：

---这里教大家一个新的思考方法，这种方法不要考虑正反

• 打开质粒图谱，选择适合线性化的两个酶切位点，如图，选择EcoRI和BamHI；

• 转到sequence页面，去掉酶切位点以及酶切位点之间的序列；

• 复制目的序列，回到snapgene中，“edit-insert-bases”，粘贴序列点insert即可；

• 接下来就是选引物，插入片段和原附近片段各取15-20nt碱基，导出即可。

• 如上图，引物大约含30-40bp碱基，直接包含重组区和片段引导序列。用这样的方法设计引物，就不用纠结哪端接到哪端，接前接后的问题了。