教程：同源重组法载体引物设计（要素过多请反复学习）

同源重组载体构建法是我在分子克隆-载体构建概要里讲得三种重要得载体构建方法之一，相比双酶切载体构建方法，同源重组法引物设计较为复杂，但省去了双酶切和连接等耗时操作，并且不受酶切位点限制，位置选择比较灵活，可以省去很多的时间和精力。接下来将从原理、引物设计、操作过程进行详细分析讲解。

• 同源重组原理

我在同源双交换解析的帖子里只是想让大家明白两次交换是如何进行，并没有讲到每次交换时同源区段DNA分子是如何进行交换的。在这里用支点移动到极限、端点开链的极限假设方法，给大家讲讲。后面说明补了hollday的解释模型，感兴趣的同学可以查文献了解。

1. 假设片段A和片段B具有同源末端，同源末端用碱基简化标注；
2. 片段A和片段B在同一体系中，因含有同源序列联会在一起；
3. 在重组酶的作用下片段A和片段B发生解链和交换重接；
4. 经历酶切、重组作用后，最后出现两种重组结果：一种是交换但由于序列不变，不产生重组；另一种是交换且重组，也是我们希望得到的结果。
   
   
5. 重组法构建载体原理：在载体和片段两端设计同源区域，重组酶将载体和片段两端分别重组，得到重组质粒。如下图，
   

• 此法引物设计

5’--上游载体末端同源序列（GC：40% - 60%） + 酶切位点(可有可无) + 基因特异性正向扩增引物序列--3’

5’--下游载体末端同源序列（GC：40% - 60%） + 酶切位点(可有可无) + 基因特异性反向扩增引物序列--3’

这里总结了设计思路的规则：先设计片段引物，主要保证片段引物特异性较高且参数较好；再设计载体线性化引物，保留启动子、终止密码子和标签（载体线性化引物在启动子/N-端标签之后，终止密码子/C-端标签之前选择），如果线性化载体的引物考虑用作重组区，F和R反向互补接在片段引物R和F前面即可，以后用作其它片段的载体时不必线性化。（口诀：先片段，后载体；片段引物看特异，载体引物看位置；线性引物设重组，反向互补接前头;F反向接在R，R则反向接F）以homo sox2为例子，通过重组的方法将Sox2构建到过表达慢病毒载体pCDH-CMV-EF1-puro上。

1. 先设计sox2片段引物，并通过NCBI比对，初步得到特异性较高的引物；sox2-f:ATGTACAACATGATGGAGACGG；sox2-r:TCACATGTGTGAGAGGGGCA
   
2. 载体线性化引物，选在启动子之后（下图1），一定要注意方向，与启动子方向一致的（较远的）引物为顺方向引物，载体引物F：GAAGGATCTGCGATCGCTCC；与启动子方向相反的（较近的）为反向引物，载体引物R：AGGCGATCTGACGGTTCACT。（远顺近反，一定不要搞错）（下图2）
   
   
3. 最终的引物：

• 载体线性化引物
• 载体F：GAAGGATCTGCGATCGCTCC
• 载体R：AGGCGATCTGACGGTTCACT
• 融合重组区域后的片段引物：（载体R引物反向互补序列接在片段的F引物前，载体F引物反向互补接在片段的R引物前）
• 融合sox2-F:AGTGAACCGTCAGATCGCCTATGTACAACATGATGGAGACGG
• 融合sox2-R:GGAGCGATCGCAGATCCTTCTCACATGTGTGAGAGGGGCA
• 再回头看口诀：先片段，后载体；片段引物看特异，载体引物看位置；线性引物设重组，反向互补接前头;F反向接在R，R则反向接F。--务必记住顺序，否则你会很乱

• 实验操作：

1. 用片段引物将带重组区域的片段扩增，以载体为模板用线性化引物将载体线性化；
2. 跑琼脂糖凝胶确定片段大小，确认片段及线性化载体大小正确后，分别纯化，测浓度；
3. 按载体使用量=[0.02×克隆载体碱基对数]ng，片段使用量=[0.04× 插入片段碱基对数]ng，加入重组体系中重组；
4. 重组后，转化，涂板，菌落PCR鉴定/送测序。

说明：

1. 重组原理中是本人自己画的模型，是一种端点开链，支点移动极限的模型，分子生物的同学可以参考holliday具体重组模型继续学习；
   
2. 也可以将片段设为重组区域，道理相同，具体看现实需求，如果不是引物参数问题建议都将载体线性化区域全部或部分作为重组区。
3. 多片段原理是一样的，但是要注意的细节更多，所以设定设计顺序就更加重要，前、后、顺、反关系一定不能搞错。