PCR跑不出来大概率是因为……
1 什么是PCR
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）可以将非常少量的 DNA 转化为非常大量的 DNA，是许多分子生物学专业技术基础[1]。尤其在水生热菌（Thermus aquaticus）中引入热稳定的DNA聚合酶，该技术的自动化和改进取得了进展，因此得名Taq DNA聚合酶 [2]。PCR技术在生物领域广泛使用，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对 [3]。
(图1 RT-PCR准备材料仪器及一个循环实现基因扩增)
2 RT-PCR常见名词解释
预变性/变性 (Denaturation)：DNA变性是指DNA双螺旋结构中碱基对的氢键断裂，使得双链变为单链的热处理过程。对双链DNA进行加热（94℃，0.5min-2min）可以使其发生变性（Denaturation），当温度升高到一定高度时，DNA在260nm（OD260是DNA的吸收峰）处的吸光度会突然发生明显的上升，并达到峰值，之后温度继续上升，其吸光度不会发生明显变化，若以温度对DNA溶液的260nm吸光度做图，会得到典型DNA变性S型曲线。增加一步预变性的目的使得DNA双螺旋解旋更彻底，同时激活热稳定的DNA聚合酶。
退火（Annealing）：反应温度降至54-60℃，反应时间约20-40秒，引物与模板DNA上的互补序列结合。这两条分离的链以相反的方向运行，因此有两个引物—上游（forward）/下游（reverse）或称为正向（sense）/反向（antisense）引物。DNA的变性发生在一个很窄的温度范围，通常将DNA加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值50%时的温度称为核酸的熔解温度 (Tm, melting temperature)，也可以简单的理解为一半的DNA解开双链。
延伸（Elongation）/终延伸：温度升高到72-80℃。在存在DNA模板 + 引物 + 2x Taqmix（老式PCR试剂被分解为：dNTPs + 酶 + MgCl + buffer）的反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，实现对靶基因片段扩增。碱基通过Taq聚合酶添加到引物的3 '端。这会使DNA在5 '到3 '方向上延伸补充。在最佳条件下，DNA聚合酶的速度约为1000bp/分钟。Taq聚合酶可以耐受很高的温度。它附着在引物上并将DNA碱基添加到单链上。结果，得到了一个双链DNA分子。增加一个终延伸能够更好的实现对目的片段的体外扩增。
保存（conservation）：一般选择4/12/16℃对扩增的片段在PCR仪器中进行短暂保存，当然一跑完PCR就取出，就没必要保存，这三个温度点有利于维持DNA双链的稳定性。
（图2 RT-PCR扩增目的片段步骤简易示意图）
3 引物（primer）
3.1 什么是引物
PCR引物（primer）是短的单链DNA片段，被设计成与将要扩增的目标序列的开始和结束互补。在聚合酶链反应中引物决定了被复制的DNA序列。
（图3 引物引导合成新的模板示意图）
3.2 引物涉及遵循规则
设计合适的引物对于PCR实验的成功至关重要。当设计一组引物到需要扩增的特定DNA区域时，一个引物应退火到正链，按照惯例，正链的方向为5'→3'方向（也称为正义链或非模板链），另一个引物应补充负链，负链的方向为3'→5'方向（反义链或模板链）（保存为5'→3'方向，因为DNA序列合成公司合成方向的要求）。在设计引物时会出现一些常见问题：1）引物的自退火导致形成二级结构，如发夹环;2）引物相互退火，而不是DNA模板，产生引物二聚体;3）熔化温度（Tm），因此很难选择退火温度，使得两种引物在主题循环过程中都能有效地与其目标序列结合。
引物涉及遵循的基本规则：
（1）引物长度应为15-30个核苷酸残基（碱基）。
（2）最佳 G-C 含量应在 40-60% 之间。
（3）引物的 3' 端应包含 G 或 C，以便夹紧引物并防止末端“呼吸”，从而提高引物效率。当末端没有退火而是磨损或分裂时，就会发生DNA“呼吸”。气相色谱对中的三个氢键有助于防止呼吸，但也提高了引物的熔解温度。
（4）引物组的 3' 端（包括正链引物和负链引物）不应相互互补，单个引物的 3' 端也不能与引物中的其他序列互补。这两种情况分别导致引物二聚体和发夹环结构的形成。
（5）最佳熔化温度（Tm）的引物范围在52-58°C之间，尽管范围可以扩展到45-65°C。 最后的 Tm对于两种引物的差异不应超过5°C。
（6）应避免双核苷酸重复序列（例如，GCGCGCGCGC或ATATATATAT）或单碱基运行（例如，AAAAA或CCCCC），因为它们会导致沿着DNA的引物片段滑移和/或发夹环结构形成。如果由于 DNA 模板的性质而不可避免，则仅包括重复或最多 4 个碱基的单碱基运行。
3.3 控制污染和模板降解
（1）工作台中准备各种材料
材料包括PCR管和盖，PCR管架，耐乙醇标记笔和一组分液量为1-10μl（P10），2-20μl（P20），20-200μl（P200）和200-1000μl（P1000）的微量移液器，以及热循环仪。
当设置多个使用相同试剂的PCR实验时，可以适当地缩放它们，并在主混合物（预混液）中组合在一起。该步骤可以在无菌的1.5ml微量离心管中完成。
为了分析PCR实验产生的扩增子，需要琼脂糖凝胶电泳的试剂和设备。为了近似PCR产物的大小，需要合适的、市售的分子量大小标准品
（2）防止污染
在设置PCR实验时，做好准备很重要。戴上手套，以免污染反应混合物或试剂。包括阴性对照，如果可能，包括阳性对照。
（3）防止试剂和模板变性或降解
将PCR实验所需的所有试剂排列在新装满的冰桶中，并在设置反应之前让它们完全解冻。在整个实验过程中将试剂保持在冰上。
标准PCR试剂包括一组用于所需靶基因或DNA片段扩增的适当引物、DNA聚合酶、特定DNA聚合酶的缓冲液、脱氧核苷酸（dNTP）、DNA模板和无菌水。
3.4 配制反应混合物
在此我们使用Taqmix进行讲解。一般情况下我们只是验证某个基因的有无或者引物的特异性，使用的总体积为10/20μL总体积即可，这样的目的是节省试剂。如果设计到需要回收目的片段，那么就需要50μL甚至更好的总体积，RT-PCT具体加样体系，请参考表1：
表1 RT-PCR加样体系
3.5 PCR仪器（热循环仪）设置
（1）PCR热循环仪可快速加热和冷却反应混合物，从而实现双链DNA的热诱导变性（链分离），将引物退火到DNA模板的正链和负链，以及PCR产物的延伸。循环时间是根据模板的大小和DNA的GC含量计算的。一般配方从94°C至98°C的初始变性步骤开始，具体取决于DNA聚合酶活性的最佳温度和模板DNA的G-C含量。典型的反应将从94°C的一分钟变性开始。任何超过 3 分钟的时间都可能使 DNA 聚合酶失活，从而破坏其酶活性。
（2）下一步是将热循环仪设置为启动三步温度循环（变性-退火-延伸）的 25 到 35 个循环。虽然将循环次数增加到 35 次以上将导致更多的 PCR 产物，但过多的循环通常会导致不良次级产物的富集。单个循环中的三个温度步骤完成三个任务：第一步使模板变性（在以后的循环中，扩增子也变性），第二步允许引物的最佳退火，第三步允许DNA聚合酶与DNA模板结合并合成PCR产物。可以改变循环中每个步骤的持续时间和温度，以优化所需扩增子的生产。变性步骤的时间尽可能短。对于大多数 DNA 模板，通常 10 到 60 秒就足够了。变性和温度可能因模板DNA的G-C含量以及斜坡速率而变化，斜坡速率是热循环仪从一个温度变为下一个温度所需的时间（斜坡率可认真研读仪器说明书）。在循环中，在低于Tm 约 5 °C 的温度下进行 30 秒的退火步骤引物（理想情况下在52°C至58°C之间）。循环以伸长步骤，温度取决于为实验选择的DNA聚合酶。例如，Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度为 70 °C 至 80 °C，需要 1 分钟才能拉长前 2 kb，然后每增加 1 kb 扩增需要额外一分钟。
（3）热循环的最后阶段（终延伸）包括 5 分钟或更长时间的延长期。最后一步允许完成许多未完成的扩增子的合成，并且在Taq DNA聚合酶的情况下，允许在所有PCR产物的3'末端添加腺嘌呤残基。这种修饰是由 Taq DNA 聚合酶的末端转移酶活性介导的，可用于需要 3'-突出的后续分子克隆程序。
（4）通过将混合物冷却至4°C和/或将EDTA加入至终浓度为10mM来实现反应的终止。
4 为什么跑不出来的原因讲解
(1) DNA模板出问题
DNA降解与否：DNA出现降解的原因很多，首先是DNA反复冻融，尤其是不按规则的反复冻融，例如，将DNA从-20℃拿出后不在冰面上化冻，有的人为了快速化冻甚至用手握溶；其次是DNA在在非洁净操作空间操作，DNA作为一种生物材料可能会与空气中的许多细菌和化学物质产生反应从而导致DNA降解；再者，平时很多的时候，提取的DNA是溶解在ddH2O中，这样是有利于后期的化学反应，但是这也加速了DNA的降解，例如洗脱时用1X TE，那么TE里边 EDTA的螯合作用能够保护DNA不被容易被降解降解，同时提供缓冲环境，因此，如果提取的DNA使用ddH2O洗脱时，应该分装成小分量，保证降解减少。
（2）DNA的质量
对于DNA的质量主要涉及三部分，及DNA纯度，浓度和降解。首先是DNA的纯度，一般使用紫外分光光度计对DNA浓度和纯度进行鉴定，纯的DNA OD260/ OD280 =1.8。在提取DNA过程中不需要的提取液务必清除干净，保证没有其他杂志的影响。在洗脱DNA的时候，可以使用少量的洗脱液（高浓度可以稀释，低浓度无法挽救）。才测量DNA浓度和纯度时，建议测量三次，取均值。一个很不幸的事情，就是DNA在细胞或组织中，甚至在提前过程中已经发生降解，这也是导致后期PCR无法扩增到目的片段的一个重要因素，因此，提取DNA或者合成DNA的样品应该是保持在生物体内的活性状态，例如有的童鞋，把样品放在室温很久才提取DNA，这样子是不行，出现这样子的原因是因为样品多或者纯粹个人原因。因此，保证提取DNA材料的生物安全性是非常重要。
（3）不合适引物
（A）物种原因，因为我们很多时候在扩展某个基因时，会选择在NCBI上边下载相应的序列进行引物设计，但是个体和物种之间的基因序列差距是很大的，因此即使我们遵循引物设计的各种规则，我们依然无法扩增到目的片段。针对这种情况设计引物时，应注意：尽量远离5’端和3’段设计多对引物，然后将成功扩展的序列进行测序，根据测序结果进行引物设计。
（B）个人原因：在设计引物时候，务必遵循引物设计的基本原则，同时在保存引物时，切实反向引物务必标记清楚，并且是调整引物的方向（5'→3'）（合成公司要求）。面对引物设计问题，可以寻求序列合成公式的帮助（一般会帮客户设计引物），其次是可以寻求实验室经验丰富的前辈帮忙。
（C）引物处理不当：在引物拿到手后，引物是粉末状还是液体状态，如果是粉末状态则需要我们自行稀释，稀释前务必高速短时离心，保证引物位于离心管底部，然后将离心管开小口将稀释液ddH2O轻柔的转移进去，然后震荡混匀，放置4℃作用1-4小时候。在稀释引物时候，务必明白引物的工作浓度，不要过高/低稀释。此外，操作尽可能在冰面和无菌操作台中进行，因为实验室空气中都已含有各种生物材料的气溶胶，这也是很多小伙伴，阴性对照也能够跑出目的条带的原因。
（4）PCR Taq酶
不合适的Taq酶：有的低含量的基因，应该使用高保真Taq酶，这样有利于成功的概率。其次，多次反复冻融的Taq酶，造成酶损伤，尤其是不恰当的冻融导致酶失活。因此，一种酶扩增不出来就换一种试试，实验只能不断尝试了，失败多了就有自己的经验了。用之前一定要认真看说明书，有时候认真看说明书。因为不同的Taq酶，最佳温度可能不一样，而扩增的最佳温度是需要Taq酶和产物的温度切合，才能实现有效的扩增。
（5）PCR仪器
PCR仪器也称之为热循环仪，它能够很好的控制循环中的温度，保证DNA的解链，延伸从而实现对目的片段的扩增。目前市面上已经有很多类型的PCR仪器，可能有得仪器对温度的控制并不是那么好，尤其是长期使用的PCR仪器，它的控制面板出现了这样子或那样子的问题，导致理论斜坡率和实际斜坡率发生了较大的改变，导致无法扩增到目的片段。因此，在出现问题的时候，也可以尝试换一个PCR仪器试一试，或许就成功了呢。
（6）循环数
对于一些低表达的基因，往往需要更多的额循环数才能够将他们扩增到被检测的数量。因此，也可以增加扩增的数量，一般不要超过40个循环，过多的循环通常会导致不良次级产物的富集，导致最终的测序或凝胶电泳检测诸多杂带。
（7）其它原因
（1）人为因素：不严格按照实验操作进行，导致DNA模板，引物，ddH2O,出现质量上的错误。例如不按照无菌操作进行，忘记添加或多添加某种试剂。
（2）实验环境因素：这里就很多啦，比如实验室空气中出现气溶胶污染，某些实验室，批量的处理大量的样品，导致空气中出现各种生物材料的污染（阴性对照阳性结果），免对这种情况，最好的办法就是开窗通风，然后使用紫外线消除等。
5 结束。
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参考：
[1] Waters DL, Shapter FM. The polymerase chain reaction (PCR): general methods. Methods Mol Biol. 2014;1099:65-75. doi: 10.1007/978-1-62703-715-0_7. PMID: 24243196.
[2] Lorenz TC. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. 2012 May 22;(63):e3998. doi: 10.3791/3998. PMID: 22664923; PMCID: PMC4846334.
