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【求助】问个258bpPCR产物回收以及双酶切的问题,多多指教!!!

最后编辑于 2022-10-09 · IP 北京北京
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这个帖子发布于 19 年零 101 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
PCR后得到的序列长度有258bp,两端分别设计了kpnI 和Bgl II的酶切位点,并分别加上了3个和4个保护碱基,查了Takara公司的双酶切缓冲液表,显示可采用1*T buffer,knpI和Bgl II在其中的活性分别为100%和60%,但是均加了括号,表明为易受star活性影响的缓冲液。
现在比较犹豫,如果采用同时双酶切,看来可能会出现star活性,258bp的PCR产物到算了,往上连接的质粒可能会受到一定影响。
如果分别采用最合适的buffer,担心的是PCR产物片段比较小,不知道好不好回收,一般的乙醇沉淀法会不会有困难。
另外,可不可在缓冲体系中直接加入NaCl来将L buffer变成H buffer,看说明书两者就差一个NaCl,其他浓度相同,这样我就可以用加热灭活的办法先灭活kpnI(L buffer),然后加入NaCl,打到H buffer,然后加入Bgl II进行酶切。不知道有人这么操作过没有...
另外请问那儿可以查到酶的灭活温度?takara目录中没有。。。
另外请问上述酶切的时间如何计算?我看按照活性好像1个小时就完事了,但是看其他贴子,好像要酶切过夜?是不是每个酶都差不多需要这样?




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