单酶切没问题，双酶切与分步酶切无目的条带

我有一个16k的大质粒，想要切下目的大小为8k多的片段。但是在第一次使用双酶切Rsr II与BsrGI-HF时，切下来的片段有在目的位置的只有1条（后来怀疑是原质粒未切开的大小），而线性化16k的位置有很亮的带。

当时怀疑是酶一起切效率不高，于是分步酶切。分别用了以上两种内切酶，与原质粒和其他HF的酶单酶切比对过，RsrII与BsrGI_HF单酶切都切出了很亮的线性化载体。但在胶回收后进行第二步，用另一种酶切第二次的时候，切完跑电泳也只看到线性化16k的大小，完全不见双酶切后的效果。

现在很疑惑，Rsr II因为不是快酶，我就30μl体系加了3μl酶，反应2μg质粒，37℃反应5小时。BsrGI-HF则30μl加1μl酶，反应2μg质粒，37℃反应2小时。以上的条件反应，单酶切都切的挺好的，但无论是双酶切还是分步酶切都出不了目的条带。希望各位前辈能给我一点建议。