WB实验求助

我每次跑的内参(GAPDH)条带很干净整齐，但是目的蛋白(40KD)条带背景深，有杂带，是什么原因？

转膜200mA，1.5小时，5%脱脂牛奶摇床封闭2h，一抗4°过夜，洗膜6min×5次，二抗室温孵育2h。