Co-IP实验实操及实验结果解读
1 概述
生命系统中几乎所有的细胞过程都由蛋白质控制：它们调节基因表达、催化化学反应、跨膜运输小分子以及跨膜传递信号。甚至，病毒感染通常是通过病毒-宿主蛋白相互作用引发的。蛋白质-蛋白质相互作用 Protein-protein interactions,PPI 是两种或多种蛋白质之间的物理接触，它们代表了复杂的生物学功能。如今，PPI已被用于构建PPI网络，以研究揭示未知蛋白质功能的复杂途径。科学家们已经使用PPIs来寻找某些疾病的分子基础以及一些潜在的药物靶点 [1]。
蛋白质已被宣布为生物功能的主要代表[2]。据报道，超过80%的蛋白质不是单独发挥作用[3]，而是经常相互相互作用或与其他分子（如DNA或RNA）相互作用以执行不同的细胞功能。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）被认为执行许多生物学过程，包括复杂的代谢途径和信号级联反应，因此了解这些关联的特殊性质至关重要[2,4]。
2 背景知识介绍
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）基于抗体和抗原之间的特异性/专一性作用用于研究蛋白质相互作用的金标准（gold standard）。相较于pull down、酵母双杂交等研究蛋白互作的方法，其特色之一便是捕获的蛋白互作发生在所研究的特定组织细胞内，保留了互作蛋白及复合体（complexes）的“内源”状态，但这些要能够达到IP级别抗体。
Co-IP实验基本过程包含四步：1、非变性蛋白提取物中添加抗体（IP级别抗体）；2、目标蛋白被抗体免疫特异性沉淀/结合；3、抗体与磁珠（含Protein A/G/其它）偶联；4、分离蛋白复合物 [5]。
（图1 蛋白复合物免疫共沉淀(Co-IP)法）
3 Co-IP实验实操
3.1 Co-IP实验过程
（1）过表达感兴趣的蛋白质粒
很多时候，通过表达感兴趣蛋白的质粒，能够得到更多的蛋白，有利于后续的检测。具体构建质粒办法，可参考2023年09月03日，GBhouse发表推文《基因过表达（Overexpression）引物（primer）设计+质粒图谱详解》。
（2）蛋白提取
细胞在非变性条件下被裂解时，细胞内存完整的蛋白质－蛋白质间的相互作用（PPI）被保留了下来 [7]。
a、用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；b、加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107 cells，也就是1ml裂解液对应100mm的细胞量)；c、用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿刮下，把悬液转到1.5 EP管中（4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）），或者直接在培养皿中裂解；d、 4℃，14000g离心15min，立即将上清转（总蛋白）移到一个新的离心管中。
（3）感兴趣蛋白的抗体孵育细胞总蛋白
使用感兴趣的蛋白的抗体加入到，提取的非变性的总蛋白中，一般是4℃摇床孵育过夜。（如果用蛋白质α的抗体免疫沉淀α，那么与α在体内结合的蛋白质X、Y等也将被沉淀下来。通过沉淀后，洗掉没免疫结合的非PPI蛋白，用WB或者测序检测一起被拉下来的蛋白中α蛋白和X、Y等蛋白）。一般这种情况使用的，是会用到含Protein A/G等的磁珠，如果使用的是琼脂糖树脂的话，一般是先将抗体与琼脂固定在一起，然后洗脱后检测。
（4）免疫共沉淀结合
将孵育过夜的混合物，加入ProteinA/G进行共同孵育，那么ProteinA/G将会与抗体的Fc结构进行特异性结合。一般这种孵育是在4℃冰箱，摇床过夜即可，实现ProteinA/G与抗体的特异性结合 （备注：蛋白 G 通常被认为是比蛋白 A 更通用的 IgG 结合蛋白，但不同的物种和物种亚型与这些蛋白质的结合确实不同，所以，做实验去要把自己研究的物种搞清楚！），可参考2024年01月03日，GBhouse发表推文《IP COIP ChiP RIP pull-down还在傻傻分不清楚？（理论知识）》。
（5）免疫沉淀物富集
将（4）获得具备磁性的磁珠，利用磁力架进行处理，磁珠将被富集，未被富集的液体吸取并作为阴性对照。磁珠ProteinA/G结合的蛋白一般使用强酸（pH3.0-3.5）洗脱，具体洗脱方式可见磁珠proteinA/G的使用说明书。
如果使用的琼脂糖树脂[6]，将750μg总蛋白转移到新管中，并用预冷裂解缓冲液将体积调节至200μl。加入50μl感兴趣抗体制备的树脂。将试管在4°C下以低速在管旋转器上孵育1小时（具体参考琼脂糖厂商提供的说明书，适当延长一些可能更好）。在4°C下以6000g离心30秒，并将200μl上清液转移到新管中，保存上清颗粒树脂作为阴性对照。在4°C下以6000g×30秒离心。将100μl上清液转移到新管中并吸出剩余的上清液。用500μl（可更具实际情况调节，浓度可以高，但不能低，高可以稀释，低就太难了）预冷裂解缓冲液重悬树脂，在4°C下以6000g×30秒离心，并吸出剩余的上清液。
（6）蛋白WB分析
将树脂结合的免疫复合物重悬于20μl 2× Laemmli缓冲液中（就是平时常用的loading buffer），煮沸5-10分钟，并通过SDS-PAGE /免疫印迹分析进行分析。
（图2 Co-IP技术操作流程示意图）
4结果解读
4.1 常见的词语解释：
（1）Input：阳性对照，及用感兴趣蛋白的抗体拉下来的蛋白；
（2）IgG:阴性对照；
（3）IP:免疫沉淀；
（4）IB:A/B：（IB（immunoblotting）即免疫印迹WB实验结果，IB:A/B,蛋白A/蛋白B的WB检测结果）；
4.2 示意图解释
针对图3的IP结果进行解读：（1）A蛋白的抗体下拉蛋白A等（因为存在互作，还有其它蛋白会被一起拉下来），那么在跑WB中，Input的蛋白和下拉的蛋白中都能用A蛋白的抗体检测到A蛋白；（2）验证A蛋白和B蛋白是否有相互作用，首先在Input的蛋白中可以用B蛋白抗体检测到B蛋白，其次在A蛋白抗体下拉的蛋白物中（IP:A）也可以用B蛋白的抗体检测到B，满足上述两个条件则说明A蛋白和B蛋白存在相互作用。
（图3 IP实验结果示意图）
4.3 实验结果解读
为了研究Protein A和Protein X的相互作用，首先，使用IP实验将蛋白A将蛋白拉下来，IgG作为阴性对照。接着，在input和IP-Protein A使用蛋白A的抗体对蛋白A进行检测（理论上是应该都能够检测到蛋白A）；最后，这张图是Protein A和Protein X存在相互作用，多以在Input（细胞裂解液，可以称之为阳性对照，理论上所有的蛋白都能够被检测到）组和IP-IP-Protein A均能检测到Protein X。希望通过图3示意图和图4具体实验结果能够让大家明白Co-IP的实验结果解读，如果不清楚，或者不完善，也请大家留言区讨论留言，大家功能学习，共同进步。
（图4 具体实验结果展示）
5 常见问题及应对措施
（1）Co-IP时，Input（阳性对照组）的WB条带型不够亮，如何解决？
可以瞬转过表达处理，也就是我们本推文的讲解的方式，讲义使用此方式去验证，减少不必要重复，此外瞬时过表达载体一般会携带GFP/HIS等标签，也有利于后期没有IP级别的抗体对应的Co-IP检测，因此，在进行过表达的时候，选择合适的载体也很重要。
（2）Co-IP/Input的蛋白上样量是多少合适？
普通的WB的蛋白上样量10 - 30μg，一般在Co-IP实验过程中，在IP和洗涤过程中会有蛋白损失，一般Co-IP实验需要50-100μg/泳道，因此在跑WB的时候需要制备打孔的SDS-PAGE凝胶，同时，保证蛋白的的浓度尽量不低于5μg/μL。
6.结束。
（爱自己！！！做科研!!! 每文格言《乌合之众》所说：群体的叠加，只是愚蠢的叠加，而个体的智慧，会被愚蠢的洪流淹没。如果有用，关注楼主GBhouse，点赞+讨论，攻击型人格请请请不要关注和阅读！！！）
参考：
[1] Protein-protein interactions: Methods, databases, and applications in virus-host study
[2] Gonzalez MW, Kann MG. Chapter 4: Protein interactions and disease. PLoS Comput Biol. 2012;8:e1002819.
[3] Berggård T, Linse S, James P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 2007;7:2833–2842.
[4] Zahiri J, Bozorgmehr JH, Masoudi-Nejad A. Computational Prediction of Protein-Protein Interaction Networks: Algo-rithms and Resources. Curr Genomics. 2013;14:397–414.
[7] https://zhuanlan.zhihu.com/p/102068869
最后编辑于 2024-01-09 · 浏览 8442
