如何通过读文献提升科研思维和课题设计能力？实战篇【做科研的大师兄】

上一帖分享了如何通过读文献提升科研思维和课题设计能力？原则篇

本帖将结合文献精读实例，为大家展示如何精读解析一篇主刊文献，并从中提取科研思维和课题设计的借鉴之处！【建议重点读文末的研究思路解读】

此次精读案例是发表在Nature上的一篇研究论文，精读内容如下：

题目:

ILC2s通过激活组织特异性肿瘤免疫增强PD-1阻断治疗效果

研究背景：

已有文献表明：ILC2s作为一种天然淋巴细胞，参与调控组织炎症和免疫且ILC2s已发现存在于多种肿瘤组织中。然而ILC2s在肿瘤免疫及免疫治疗中的作用尚未阐明。

ILC2s激活

多种细胞因子（IL-25、IL-33、TSLP、TL1A等）可以作用于ILC2s表面受体，激活ILC2s，促进其扩增并释放2型免疫细胞因子IL-4、IL-5、IL-9、IL-13，参与免疫调控（如下图）。关于更多ILCs的背景知识，可以查阅之前文章一文详解天然淋巴细胞（ILCs）—肿瘤免疫研究新宠，快上车了解！

细胞因子激活ILC2

本研究要解决的科学问题是：

ILC2s在肿瘤免疫和免疫治疗中的具体作用是什么?

研究模型：

1. 自发胰腺癌KPC小鼠模型；
2. 胰腺癌原位瘤模型；
3. IL33敲除小鼠模型；
4. ILC2s条件性敲除小鼠模型；
5. DC敲除小鼠模型；
6. PD-1敲除小鼠模型；
7. CD45.1和CD45.2小鼠。

研究结果：

1.人和小鼠胰腺癌组织中存在IL33依赖的ILC2s浸润

为了研究ILC2s在胰腺癌中的作用，作者首先比较了人胰腺癌患者外周血、胰腺正常组织和胰腺癌肿瘤组织中ILC2s浸润情况，发现在胰腺癌肿瘤组织中ILCs明显富集，且这群ILCs表现出显著的ILC2s表型（图a）。通过分析胰腺癌患者生存，发现生存时间越久，则ILC2s水平越高；且生存分析提示ILC2s水平越高，患者生存时间越久（图b），提示ILC2s很可能发挥抗肿瘤免疫作用。接着，作者对人胰腺癌组织进行了bulk RNA seq，比较分析了可以激活ILC2s的细胞因子IL33、IL25等表达水平在胰腺癌患者生存预后和抗肿瘤作用之间的相关性，发现其中只有IL33与预后显著相关，其表达水平越高，生存时间越久（图c左）。且IL33表达水平与抗肿瘤signature呈正相关（图c右），提示IL33很可能通过激活ILC2s发挥抗肿瘤作用。接着，为了从动物模型验证以上猜想，研究首先比较了小鼠自发胰腺癌模型和原位瘤模型中ILC2s的浸润情况，发现两种胰腺癌小鼠模型都能模拟人PDAC中ILC2s表型（ILC2s在肿瘤组织显著增加），表明ILC2s在胰腺癌人和小鼠中的保守性，这两种模型可以作为后续实验研究ILC2s在胰腺癌中作用的可靠模型！为了证明IL33通过激活ILC2s发挥作用，作者在IL33敲除小鼠模型构建胰腺癌原位瘤，流式检测肿瘤组织ILC2水平，结果表明IL-33敲除之后，小鼠肿瘤组织中ILC2水平显著下降。以上结果证实，胰腺癌组织中增多的ILC2具有IL33依赖性。

2.IL33-ILC2轴激活组织特异性的抗肿瘤免疫反应

已有文献报道，ILC2s具有组织特异性，为了探究在胰腺癌中ILC2作用是否也有组织特异性，本研究首先在IL33敲除小鼠（间接形成ILC2敲除模型）中，分别构建胰腺癌原位瘤（胰腺特定组织环境）和皮下瘤（肺胰腺组织环境）两种移植瘤模型。结果表明，IL33敲除（ILC2缺失）可以显著促进原位瘤模型的肿瘤恶性表型（肿瘤生长更快、小鼠预后更差）（图a）。相比之下，在皮下瘤模型中，IL33敲除（ILC2缺失）对肿瘤恶性表型基本无影响（图b），证实IL33敲除（ILC2缺失）的促癌作用具有组织特异性。接着，为了回答IL33-ILC2轴如何发挥抗肿瘤免疫作用的问题，本研究利用RNA-seq分析了IL33+/+ vs IL33-/- PDAC原位瘤肿瘤内CD45+细胞转录组，发现IL33敲除（ILC2缺失）时，MHCI抗原提呈基因集合T细胞介导免疫基因集显著下调(附图3)，提示IL33-ILC2轴很可能通过影响CD8T细胞priming过程发挥抗肿瘤免疫作用。进一步流式分析表明，IL33敲除（ILC2缺失）胰腺原位瘤肿瘤组织中CD8T细胞明显减少，且细胞毒作用显著降低（图c）。为了证实以上猜想，本研究在IL33敲除基础上继续清除CD8T细胞，发现在CD8T细胞删除情况下，IL33敲除（ILC2缺失）的促癌作用消失，证明IL33-ILC2轴发挥作用完全依赖于CD8T细胞（图d）。接着，本研究利用肿瘤排斥率这一指标反映抗肿瘤免疫程度，进一步证实了IL33-ILC2轴的抗肿瘤免疫具有胰腺组织特异性（图e）。进一步的，本研究将ILC2删除后构建胰腺原位瘤和皮下瘤模型并检测肿瘤排斥率、肿瘤体积、CD8数量和肿瘤OVA抗原特异性CD8T细胞百分比（图f、g），结果也证实了IL33-ILC2轴的抗肿瘤免疫具有胰腺组织特异性。

3.ILC2通过招募DC促进胰腺癌组织特异性抗肿瘤免疫

既然研究发现IL33可以激活ILC2发挥抗肿瘤作用，那么直接给予胰腺癌原位瘤模型小鼠重组rIL33是否也能发挥抗肿瘤作用呢？研究发现，通过直接给予rIL33可以发挥很好的抗肿瘤作用，而且具有胰腺组织特异性（图a，原位瘤有作用但皮下瘤无效果）。胰腺组织中ILC2表面特异性表达IL33R，为了证实rIL33通过ILC2表面IL33R使其特异性激活进而导致抗肿瘤免疫组织特异性，研究又利用皮下组织中ILC2特异表达IL18R这一特点，通过rIL18激活皮下瘤中ILC2，而不能激活胰腺组织中ILC2，通过原位瘤模型证实rIL18处理只对皮下瘤有作用，对于原位瘤无作用（图b）。以上结果证实IL33-ILC2轴组织特异性抗肿瘤免疫依赖于ILC2表面特异性细胞因子受体。接着流式分析证实，rIL33处理可以显著增加胰腺原位瘤肿瘤组织和浸润淋巴结中ILC2的扩增（图c）。既然第二部分结果已经证实IL33-ILC2轴发挥抗肿瘤作用依赖于CD8T细胞priming，那么ILC2是如何促进CD8T细胞激活的呢？众所周知，CD8T细胞激活依赖于树突状细胞DC，本研究自然而然首先检测了ILC2对DC的影响。结果发现rIL33处理（ILC2增加）可以显著促进肿瘤组织中DC浸润（图d）。而在ILC2条件性敲除小鼠中rIL33处理并不能引起DC浸润显著增加（图e），证实rIL33通过ILC2促进了DC浸润。那么ILC2如何促进DC浸润的？本研究利用了单细胞测序，分析发现肿瘤浸润的ILC2高表达趋化因子CCL5（附图8）,而CCL5已报道可以趋化DC，通过体外趋化实验证实了CCL5对DC的趋化作用（图h）。同时，本研究利用DC敲除小鼠，证实IL33-ILC2发挥抗肿瘤作用依赖于DC（图g）。以上结果证实，ILC2通过招募DC促进胰腺癌组织特异性抗肿瘤免疫。

4.rIL33联合PD-1单抗方案增敏单独PD-1抗肿瘤免疫效果

该研究中同时发现rIL33激活ILC2过程中，伴随着ILC2表面免疫抑制分子PD-1高表达（附图9），这提示可以利用rIL33联合PD-1单抗进一步释放ILC2的抗肿瘤免疫效能。为了证实这一猜想，本研究对胰腺癌原位瘤模型给予四种治疗方案（图a）,发现rIL33联合PD-1单抗具有最佳的免疫治疗效果（图a）。流式分析结果表明rIL33联合PD-1单抗可以最大限度促进ILC2扩增（图b）。对这四种方案处理肿瘤组织中分选出来的ILC2进行单细胞测序，结果表明rIL33联合PD-1单抗处理组ILC2具有明显不同的转录特征（图c）。而在ILC2敲除小鼠中，rIL33联合PD-1单抗的方案效果明显被削弱（图d）。为了进一步证实这种rIL33联合PD-1单抗方案的有效性，本研究进一步纳入两种动物模型（图e，f），实验结果与预期一致，证明rIL33联合PD-1单抗方案可以显著增强单独PD-1单抗免疫治疗效果（图g-i）。

至此，本文证实了在胰腺癌组织中，IL33通过表面受体ILC33R激活ILC2，促进CCL5表达，招募DC到肿瘤微环境，进而priming CD8T并增强抗肿瘤免疫这一调控模式（IL33-ILC2-CCL5-DC-CD8T）。并基于研究发现开发出rIL33联合PD-1单抗有效治疗胰腺癌的方案！

研究思路解读

本研究集中关注ILC2在胰腺癌肿瘤免疫和免疫治疗中的作用，通过体内、体外实验证实ILC2如何发挥抗肿瘤作用以及ILC2如何在肿瘤中扩增这上下游两块内容。这种研究ILC2参与肿瘤免疫的逻辑，非常值得借鉴。本研究集中利用动物实验模型反复证实核心观点，对于机制细节很少利用体外实验展开（如ILC2如何分泌CCL5招募DC这一块机制研究尚不深入）。对于我们，在缺乏这么多敲除动物模型条件下，可以通过更多体外机制实验补充，在机制这一块做的更扎实也是一大亮点。

1. 为何选择ILC2作为研究切入点？

文中开头直接切入，指出ILC2s作为一种天然淋巴细胞，参与调控组织炎症和免疫且ILC2s已发现存在于多种肿瘤组织中。然而ILC2s在肿瘤免疫及免疫治疗中的作用尚未阐明，因此以ILC2作为切入点。仔细思量，这很可能并不是真实选择ILC2的原因。而且，本文并未展示任何关于ILC1和ILC3这两类亚群在胰腺癌中的水平以及作用，也没有用排除法证实ILC2在胰腺癌中的特殊性，比如含量最丰富等数据。推测直接选择ILC2作为切入点，定然另有原因，很可能该研究团队通过其具有的其它预实验数据或组学数据，提示ILC2在胰腺癌中的作用，或者ILC1和ILC3在胰腺癌中的作用该团队也在进行，出于保密故而没有展示相关数据。

2. 调控模式如何设计？

本研究提出的IL33-ILC2-CCL5-DC-CD8T这一调控模式是如何设计的？首先，以ILC2为研究焦点，向下游探究ILC2可以增强抗肿瘤免疫，RNA-seq组学数据提示ILC2很可能通过priming CD8T细胞发挥抗肿瘤免疫作用，而CD8T细胞priming最重要的是DC介导，因此只需找到ILC2是否可以招募DC，而DC的招募需要趋化因子（包括CCL5），作者通过分析ILC2组学数据，发现高表达CCL5，因此下游逻辑就可以串联起来，即ILC2-CCL5-DC-CD8T。接着考虑上游，ILC2是如何在肿瘤组织增加的。免疫细胞在组织增加有两种方式：被趋化因子招募而来或者在组织内扩增。考虑到ILC2大多是定居在组织中，所以优先想到ILC2是局部扩增增加导致数量增多。那么ILC2如何实现在肿瘤组织中局部扩增呢？基于之前文献报道细胞因子IL25、IL33等可以促进ILC2扩增，因而本研究比较分析了可以促进ILC2扩增的细胞因子水平，发现IL33在胰腺癌组织中水平最高，而且与胰腺癌患者预后显著相关，且与抗肿瘤免疫评分正相关，加之胰腺组织中ILC2表面特异表达IL33R，因此上游也完成了逻辑连接，即IL33-IL33R-ILC2。上下游逻辑实现打通串联之后，整个文章的调控模式就构建出来了，剩下的就是通过体内、体外实验数据支持这一调控模式！