【大师兄带你读文献】Nature教你如何整合文献提出科学猜想及如何选择最佳研究模型？

今天跟大家分享一篇2022.11.2发表在主刊Nature上的关于伤害感受神经元调控肿瘤免疫的研究论文，通讯作者是加拿大的Sebastien Talbot教授。

本文work model如下：

摘要：

实体瘤具有普遍的神经浸润，这些神经来源于自主神经或外周感受神经。 疼痛感受神经（外周感受神经的一种）在肿瘤中的分布和肿瘤免疫之间关系尚不清楚。本研究发现，肿瘤细胞通过分泌SLPI蛋白，作用于疼痛感受神经元细胞，促进神经轴突形成，并激活其释放神经肽CGRP，作用于CD8+T细胞表面受体Ramp，促进CD8耗竭状态形成（PD1+TIM3+LAG+）。去除瘤内疼痛神经分布，可以重新激活抗肿瘤免疫，发挥抗肿瘤作用。

研究背景：

1.已有研究发现， CD8耗竭状态，表达PD1/TIM3/LAG3，肿瘤细胞通过表达相应受体，促进PD1+TIM3+LAG3+CD8 T增多，导致抗肿瘤免疫被抑制；

2.已有研究发现，实体瘤中存在明显神经纤维分布，这些神经纤维一部分来源于自主神经、另一部分来源于外周感受神经，这些瘤内神经促进肿瘤恶性表型（生长及转移）；

3.已有研究发现，头颈癌中外周感受神经元可以促进肿瘤生长；

4.已有研究发现，神经元可以分泌神经肽调控免疫细胞功能（非肿瘤疾病）;

5.已有研究发现，伤害感受神经元属于外周感受神经元，且可以分泌神经肽调控免疫反应（非肿瘤疾病）。

整合以上背景文献提出本研究科学猜想：

这里的整合文献提出猜想的逻辑主要是类比推理的方法，具体如下：

1.外周神经元在实体瘤中广泛分布，且常常发挥促癌作用，伤害感受神经元作为外周神经元的一种，逻辑上应该也具有促癌作用；

2.伤害感受神经元在炎症模型（非肿瘤）中可以直接分泌神经肽，作用于免疫细胞，发挥免疫调控作用，加上第1点推理伤害感受神经元促癌作用，以及促癌在肿瘤免疫上的体现就是导致免疫抑制，因此可以推出伤害感受神经元在肿瘤免疫中，逻辑上存在促进肿瘤免疫抑制，发挥促癌作用的可能；

3.肿瘤免疫抑制形成中CD8T细胞功能耗竭是主要因素，因此，结合第2步推理，可以继续推出，伤害感受神经元、CD8T、肿瘤细胞，这三者之间应该存在一种crosstalk（互作），最终导致肿瘤微环境免疫抑制形成，促进肿瘤发展。

由以上3步推理可提出本研究科学猜想如下：

伤害感受神经元（nociceptor）—CD8T—肿瘤细胞三者之间存在相互调控，影响肿瘤免疫？

后续研究都是为了探究这三者之间的具体crosstalk方式及机制，使得本研究的逻辑环路逐渐清晰构建起来。

研究模型选择：

本研究选择黑色素瘤作为模型，探究伤害感受神经元与肿瘤免疫的关系，其实也有深意。背后逻辑：因为伤害感受神经元，作为外周感受神经元，是神经末梢感受器，在皮肤分布最为丰富，而黑色素瘤发生部位在皮肤，所以选择黑色素瘤为研究模型，最为合适。类似的，如果选择其他器官进行神经和肿瘤免疫之间调控，也应关注该器官哪种神经分布较为丰富，且该器官肿瘤中哪种神经浸润较多，这些都是保证可以设计出最佳可行性课题的前提。

研究结果：

1.黑色素瘤有广泛的伤害感受神经元分布，且黑色素瘤细胞可以激活伤害感受神经元分泌神经肽CGRP

为了探究前期综合文献报道+逻辑推理提出的科学猜想，本研究首先通过免疫组化检测发现黑色素瘤肿瘤组织中伤害感受神经元（TRPV1标记）分布明显高于癌旁组织（图a-g）。接着通过相关性分析，发现伤害感受神经元与肿瘤中浸润淋巴细胞（包括耗竭型CD8）之间也存在显著正相关（图h）。

于是初步实验结果提示猜想中的三者之间存在相关，如下：

相关性不具有方向性，是构建因果上下游逻辑关系的重要提示。因此，本研究继续深入实验，利用皮下瘤模型和共培养实验，证实，黑色素瘤细胞可以促进伤害感受神经元轴突延长，向肿瘤浸润。

同时，经过实验证实，黑色素瘤细胞可以激活伤害感受神经元（钙离子内流增多）。文献报道，伤害感受神经元被激活后可以通过分泌三种神经肽调控免疫，分别是VIP/SP/CGRP。本研究发现，黑色素瘤细胞激活伤害感受神经元这三种神经肽分泌，其中CGRP分泌增水平最高，因此选中CGRP作为后续研究切入点（图b-c）。同时通过RNA-seq分析，证实了黑色素瘤细胞可以促进伤害感受神经元高表达CGRP的编码基因Calca（图d-e）。

基于第一部分数据，可以将本研究提出的研究模式进行第一步的完善，如下图：

2.肿瘤细胞分泌SLPI促进伤害感受神经元释放CGRP

接着，本研究继续探究，既然黑色素瘤细胞可以激活伤害感受神经元，那么具体机制是什么？为了一探究竟，本研究分别将肿瘤细胞单独培养，或与CD8T细胞和伤害感受神经元共培养，然后再分选出肿瘤细胞进行了RNA-seq组学分析。最终选定SLPI基因作为机制切入点（图a-c）。选择SLPI基因的理由如下：1.肿瘤细胞作用于伤害感受神经元主要通过分泌途径，因此，候选基因需要为可分泌蛋白，2.候选基因需要在不同共培养模式下的肿瘤细胞中都有上调。基于以上标准，最终锁定了SLPI。后续通过实验证实了肿瘤细胞来源的SLPI是可以直接激活伤害感受神经元，促进神经元高表达分泌CGRP神经肽(图d-f)。

基于第2部分结果，本研究的科学猜想又得到一定水平的完善如下图：

3.基因删除或化学抑制伤害感受神经元可恢复抗肿瘤免疫

接着，继续深入探究研究猜想，那就是伤害感受神经元对CD8介导的抗肿瘤免疫有何影响？首先还是相关性分析，结果表明伤害感受神经元的激活和CD8耗竭状态显著正相关（图a）,这提示，伤害感受神经元很可能导致CD8T的免疫耗竭。为了证明这一想法，继续利用基因工程-白喉毒素受体特异敲除小鼠伤害感受神经元，并再接种黑色素瘤，发现伤害感受神经元被清除后，荷瘤小鼠生存延长（图b），肿瘤生长被抑制（图c），效应CD8T增多（图d），耗竭CD8减少（图e），表明抗肿瘤免疫增强。为了证明伤害感受神经元清除后的抗肿瘤作用依赖于增强的CD8T功能，又进行了CD8的deplition，发现在缺失CD8之后，伤害感受神经元清除变不再具有抗肿瘤作用，证实了伤害感受神经元就是通过促进CD8T耗竭，导致免疫抑制，发挥促癌作用。除了基因敲除手段，同时利用了药物抑制伤害感受神经元，达到了如上相同结果。

基于第3部分结果，可以进一步完善科学猜想如下图：

4.CGRP介导伤害感受神经元对CD8T的耗竭

接着以上科学猜想，衍生下一个问题，即肿瘤细胞分泌SLPI促进伤害感受神经元分泌的CGRP是否介导伤害感受神经元对CD8的耗竭？本研究以下实验证实，伤害感受神经元分泌的CGRP可以直接作用于CD8表面RAMP受体，促进CD8T耗竭。并结合公共数据分析和抑制剂靶向RAMP或敲除CD8T表面RAMP回输Rag-/-实验，首次证实CD8T细胞表面RAMP受体确实是导致其耗竭的重要分子。

基因第4部分结果，可以最终完善了本研究的猜想即work model如下：

小结

本研究最大创新之处在于首次发现外周伤害感受神经元可以导致CD8T免疫耗竭，进而促进肿瘤免疫逃逸的这一调控模式。具体分子机制上，本研究逐步递进，每一步都是基于组学数据和/或相关性分析找到机制切入点，并通过因果上下游关系确证和回补再证扎实的确定每一步逻辑环路，最终提出一下work model，揭示了黑色素瘤免疫逃逸的新机制，该机制也为免疫治疗抵抗提供新的靶点。