基因过表达构建攻略（一）

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医疗行业从业者 · 最后编辑于 2022-10-09 · IP 北京北京

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dachong99 +8 丁当

这个帖子发布于 4 年零 232 天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

发现了感兴趣的基因，想让它在自己养的细胞中过表达，该如何实现呢？

目前来说，让基因过表达的方式主要有三种，构建外源基因过表达，CRISPR SAM，saRNA。这里我们主要介绍下构建外源基因过表达。

首先，我们需要获得目的基因序列，可通过NCBI中的Gene数据库进行查找，这里以GPX4为例。

选择人源的基因，进入下级界面

往下翻，直到mRNA and Protein(s)

如果有异构体，根据需要选择，这里我们以第一条为例，点击进入下级界面

向下翻到CDS，CDS指的是编码序列（Coding sequence）

点击进入

点击FASTA,进入下级界面

在该界面中我们可以得到目的基因编码序列和大小（右上角）。

接下来我们要选择适当的质粒载体，根据实验室现有或购买的慢病毒质粒载体图谱，选择适宜的两个酶切位点（1.两个酶切位点距离大于6bp; 2.常见的限制性内切酶位点；3.可用同一buffer）。另外，在选择酶切位点时须确保目的基因片段中不含所选择的酶切位点（具体方法参见文末）。值得注意的是，本文介绍的是传统的双酶切法，如果使用同源重组法则会省事很多。

有了目的基因序列，确定好质粒中的酶切位点后，我们要做的就是将该基因片段插入质粒两个酶切位点之间。

如何实现呢？首先需要得到带酶切位点的基因片段。可以让公司合成，也可以PCR获取。这里就介绍下如何通过PCR得到带酶切位点的基因片段。

首先在NCBI找一下该基因高表达的组织细胞

用该基因高表达的细胞提取RNA（Trizol或者相应试剂盒提取）,反转录后（反转录试剂盒）用合成好的带保护碱基及酶切位点的引物（带酶切位点引物设计方法见文末）进行PCR（使用高保真酶进行PCR,避免错配）。PCR条件根据需要调整和优化。随后将PCR产物进行琼脂糖电泳（通常是1%），切下目的基因片段对应的胶块，进行胶回收（使用胶回收试剂盒），胶回收后测DNA浓度（通常用Nano drop仪测）。此时我们就获得了带酶切位点的基因片段。

接下来我们对带酶切位点的基因片段和载体质粒分别进行双酶切，得到粘性末端。常用的NEB酶切体系效率挺高，一般5-15分钟就完成了。如果担心酶切不彻底，可适当延长酶切时间（酶切反应可在EP管或pcr管中进行，采用37度金属浴）。

酶切完成后，对目的基因和质粒进行琼脂糖电泳及胶回收，测定胶回收产物浓度，此时的目的基因及载体质粒上均带有双酶切位点粘性末端。

通过T4连接酶对目的基因及质粒进行连接操作，反应体系，连接时间及温度参考购买的T4连接酶说明书。

连接完成后，我们取5微升产物进行转化（转化是指将目的质粒导入感受态细胞的过程）。

以stable3感受态细胞为例，从-80度冰箱取一支stable3感受态细胞，置于冰上解冻，数分钟后加入5微升连接产物，轻柔混匀，冰上放置30分钟，42度水浴90秒（或者45秒），该步骤称为热激。冰上放置2分钟后，加入500微升SOC（购买的stable3感受态细胞会附带SOC）或者LB培养基。放入摇床，设置37度200rpm转速复苏一小时，如果担心质粒发生错误重组，可将温度降至30度。

将复苏好的感受态细胞以300G转速离心5分钟，弃上清，留下50至100微升液体，吹匀后将菌液加入带相应抗性（根据质粒抗性而定）的选择性固体培养基平板（常用的是氨苄），用接种环划线，静置数分钟（晾干），倒置平板放入37度培养箱，12-16小时后取出已经长出细菌的选择培养基平板。

准备数个含抗性的LB培养基摇菌管，挑取数个单菌落，每个摇菌管加入一个单菌落，37度摇床200rpm转速摇菌，12-16小时后取出。

此时可将菌液送去测序（或者对菌液小提后，将质粒送去测序），也可以先对菌液PCR,通过琼脂糖凝胶电泳确定是否含目的基因，再将含目的基因的菌液（或者提出的质粒）送去公司测序。测序需要我们提供测序引物，可设计合适引物将目的基因测通，引物设计这里略去，不会设计可以让测序公司帮忙设计（一般不收费或者很便宜）。

待测序结果返回后，我们对结果进行比对，如果无误，我们的过表达质粒就算构建好了。

有了过表达质粒，我们就可以构建过表达细胞株了，具体步骤，我们下期继续。

Tips：Ⅰ分析目的基因所含酶切位点，确保选定酶切位点不在目的基因中，以经典的primer 5软件为例。

复制目的基因序列到primer 5