一个值得学习WB的贴子（原理、蛋白的提取、试剂配制、流程、视频、结果分析）

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发布于 2019-05-31 · 浏览 3.2 万 · IP 湖北湖北

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yj1984ren 推荐

原理流程和结果就不在这儿赘述了，Western Blot 原理、protocol--及条带常见问题分析一贴很详细啦；此贴主要分析蛋白的提取、WB相关试剂配制，另外还有WB操作视频哦！欢迎大家讨论！希望大家能多多支持

一、蛋白提取：

对于培养细胞样品：
1.融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
2.对于贴壁细胞：去除培养液，用冷的PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍；按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用*吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。
对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。冰上裂解30min。
3.充分裂解后，4℃(提前预冷）,10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入100微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150微升或200微升。每100万细胞用100微升本产品裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为2-4mg/ml，不同细胞有所不同。
对于组织样品：
1.把组织剪切成细小的碎片。
2.融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
3.按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)
4.用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解，冰上裂解30min。
5.充分裂解后，4℃,10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200微升本裂解液裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为15-25mg/ml，不同状态的不同组织有所不同。
6.如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

以上裂解参考所选裂解液说明，一般都是加：裂解液+PI+PMSF（PMSF有毒，对皮肤有害，记得戴手套哦！），然后吹打均匀，冰上裂解30min后，低温高速离心（一般12000rp,4℃)，吸取上清，标记、低温保存！

附上蛋白质的不同，裂解液如何选择：

二、WB相关试剂配制：

1、10%过硫酸铵（AP）：

1 g AP+10 ml ddH2O （4℃保存一个月，可现配）

2、30% 丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺（pH<7.0）：

29 g Acr + 1 g Bis 加ddH2O至100 ml （过滤，4℃避光保存，使用前恢复室温且无沉淀，一定要注意过滤，不然影响上样和跑胶，记得 4℃避光保存）

丙烯酰胺: Acrylamide, 甲叉双丙烯酰胺: Bis-acrylamide

3、10% SDS: 十二烷基硫酸钠

10 g SDS加ddH2O至100 ml （用前50℃水浴充分溶解，可用15ml管分装）

4、TEMED 毒！可用1.5ml EP分装，锡纸避光

5、1.5 M Tris.HCl （pH 8.8）：

Tris 18.2 g + ddH2O 溶解，浓HCl调pH 至8.8，定容至100 ml

6、1 M Tris.HCl （pH 6.8）：

Tris 12.12 g + ddH2O 溶解，浓HCl调pH 至6.8，定容至100 ml

7、10× 电泳缓冲液（pH 8.3）：

（250 mM Tris，2.5 M 甘氨酸， 1% SDS）

Tris 15.15g +甘氨酸93.85g + SDS 5g + ddH2O 至500ml，加热溶解

8、1× 电泳缓冲液现配现用：

Tris 3.03g + 甘氨酸18.77g + SDS 1g + ddH2O 至1000ml ，或者：10× 电泳缓冲液用ddH2O稀释到一倍！

9、10× 转膜缓冲液（pH 8.3）：

（1.920M 甘氨酸，250 mM Tris）

甘氨酸 72 g + Tris 15.15 g + ddH2O 至500 ml，加热溶解

9、1× 转膜缓冲液（pH 8.3）现用现配：

Tris 3.03 g + 甘氨酸 14.4 g+ 800ml ddH2O + 200 ml甲醇=1000ml，或者按照：10× 转膜缓冲液：甲醇：ddH2O=1:2:7比例配制

注意4°保存，甲醇在使用前加，加后注意密封保存以免甲醇挥发

10、10× TBS ：

(250 mM Tris， 1.5 M NaCl)

Tris 15.14g + NaCl 43.83g + ddH2O至500 ml

11、1× TBST (0.05% Tween 20的TBS) 4°保存一周

Tris 3.03g + NaCl 8.77g + 1000 ml ddH2O +0.5 ml Tween-20，调PH=7.6（1640ul Hcl），或者：10× TBS 用ddH2O稀释到一倍，再加体积0.05% 的Tween 20

12:、封闭液和抗体稀释液（含5%脱脂奶粉或5% BSA的TBST）：

脱脂奶粉 5g或 BSA 5 g + TBST 至 100 ml

按理说以上容易配制需要定容的，定容最好，试剂比较好，但也可以不一定定容的。一倍的电泳液和一倍的转膜液不建议重复利用的，但是如果重复利用的话，次数不要太多了，平时我用一到两次的；顺便说一下，上面试剂有些成分的作用：

AP：加速凝胶形成（催化作用）；

Acrylamide, 、 Bis-acrylamide：Bis-acrylamide为一种交联剂与丙烯酰胺（Acrylamide）一起在催化剂（如核黄素、AP）的作用下用于聚丙烯酰胺凝胶（PAGE胶）的配制，包括SDS-PAGE胶等，主要用于蛋白或核酸的分离。根据丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度不同，可形成具有不同大小孔径的凝胶，从而分离不同大小的蛋白或核酸；

Tris-HCI：三羟甲基氨基甲烷，起缓冲作用；

SDS：