【求助】关于sal1和Bgl II酶切pIRES2-EGFP的问题
发布于 2005-08-07 · 浏览 2209 · IP 山东山东
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各位高手,请帮我看看这个问题出在哪里?
我用sal1和Bgl II酶切pIRES2-EGFP,最初是双酶切，反应体系是50ul，用的10*BUFFE，电泳出来也是一条带，比质粒要大，当时考虑也切下来，回收之后做连接，但一直不成功，后来考虑是自身环化或者当时根本就没有切下。
后来用sal1和Bgl II分别单酶切，都用的10*BUFFER，反应体系是水33ul,pIRES2-EGFP10ul,Bgl II2ul,10*BUFFER5ul,一共50ul。一共做了六个小组，发现sal1酶切比较完全，但所有的Bgl II均切不开，Bgl II切的电泳后全是两条带，和纯质粒电泳基本一致，考虑是没有切下来,回收一部分片断,再用Bgl II酶切,结果还是一样。 刚才查文献说Bgl II酶切一个小时就可以了，我现在一般是37度过夜，可能会影响一些，但不至于完全切不开吧 。
另外,我还用这两个酶切过别的质粒,非常顺利,所以不应该存在酶活性的问题,
请大家帮我找找原因啊.谢谢!
我用sal1和Bgl II酶切pIRES2-EGFP,最初是双酶切，反应体系是50ul，用的10*BUFFE，电泳出来也是一条带，比质粒要大，当时考虑也切下来，回收之后做连接，但一直不成功，后来考虑是自身环化或者当时根本就没有切下。
后来用sal1和Bgl II分别单酶切，都用的10*BUFFER，反应体系是水33ul,pIRES2-EGFP10ul,Bgl II2ul,10*BUFFER5ul,一共50ul。一共做了六个小组，发现sal1酶切比较完全，但所有的Bgl II均切不开，Bgl II切的电泳后全是两条带，和纯质粒电泳基本一致，考虑是没有切下来,回收一部分片断,再用Bgl II酶切,结果还是一样。 刚才查文献说Bgl II酶切一个小时就可以了，我现在一般是37度过夜，可能会影响一些，但不至于完全切不开吧 。
另外,我还用这两个酶切过别的质粒,非常顺利,所以不应该存在酶活性的问题,
请大家帮我找找原因啊.谢谢!
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 2209
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