大家好，我刚做qpcr，发现阴性对照ct值总是很高，一般在16到24之间起来
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如题，我是一名刚做pcr的小白，这个问题困扰我多久了，可能叙述会很啰嗦。
我的模板很短，只有30多个bp（Tm70℃），因此我设计的引物也很短,一个11bp，一个15bp，两个引物Tm值40℃左右，（我看网上设计引物的网站或者软件都不能用，因此自己根据大概的原则设计了一下），引物定回来后先做了普通pcr，琼脂糖凝胶跑胶后发现位置差不多于是就拿这对引物用了。
做qpcr是用的sybergreen法，我按照说明书配置的体系，退火温度50℃（一开始设置的35℃，后来感觉溶解曲线很乱，就做了个温度梯度），40个循环，我将模板进行梯度稀释（模板原液是10uM），然后结果发现从稀释到10万倍开始曲线ct值就没差别了，也和阴性对照没有差别。阴性对照ct值总是在16到24之间起来，重复了几次都没法消除，感觉像是污染了，于是换了试剂，换了实验室再次做还是这个结果，楼主作为一个刚刚开始做实验的新手简直要抓狂了，求助啊，现在很迷茫，不知道该怎么做下去。如图是最新一次的扩增和溶解曲线。
