从RNA提取到qPCR详解

提取总RNA                                     

！RNA的提取需要无RNA酶环境。为了提取高质量的RNA，提取前可以紫外照射15min，灭菌并使空气中的酶类变性；使用无RNA酶的枪头、EP管和提取相关溶剂；实验者带口罩以及新的手套进行试验。如实验环境不允许，请快速操作。（空气中RNA酶是一个固定存在,一个原因是很多生物都能分泌它,导致它的数量很多；再有一个原因就是它的稳定性非常好,即使是高温灭菌也不能使其灭活。RNA酶酶解RNA条件简单，不需要金属离子，多为外切酶序列特异性低，并且温度限制不大,因此RNA在自然界中很容易就被降解。）

1）裂解细胞

平皿上的细胞：去掉培养基，用PBS洗两次，加入1ML Trizol，用枪头吹下细胞转至EP管中，静置裂解5min；

组织：加入少量液氮研磨，加入1ML Trizol，转致EP管中，静置裂解5min，13000rpm离心，取上清；（组织匀浆器：将组织剪成小块与1ML Trizol一并加入到匀浆机中，研磨至无组织块后放置2-3min，13000rpm离心，取上清）

2）萃取除杂

加入0.2ML 氯仿，vortex 30s，静置3min，4℃，13000 rpm离心10min，小心吸取上清转至新的EP管中（上层为RNA，中层和下层含有DNA和蛋白）

3）沉淀RNA

加入等体积异丙醇，翻转颠倒6-10次，静置10min（-20℃或者-80℃放置30min以上效果更好），4℃，13000 rpm离心10min，去上清

4）洗涤

用0.5ML75%的乙醇洗两遍，4℃，12000 rpm离心5min，风干

5）溶解

加入20-100ul  无RNA酶的水溶解RNA。

（这里按照3.5mm平皿添加试剂举例，其它平皿按照比例增减。提取RNA还有CTAB、SDS法等，并且有很多公司以这几种方法为基础开发出 RNA 柱式提取方法，多数是裂解液里带有蛋白变性剂和DNA酶，其它 原理基本一致）

逆转录cDNA                                    

逆转录步骤通常公司说明书自带，通常含有 oligo(dT)、dNTPs、RNA inhibitor、病毒逆转录酶和buffer（现在部分公司逆转录试剂包含了去除基因组DNA的酶在buffer里，但部分没有因为影响体系或消化新合成的cDNA，那就需要在逆转录之前先加DNase I 自己消化去除。那么DNA污染对于qPCR有没有影响呢？对于80%的引物和反应条件是有影响的，这部分引物在这个反应条件下会以DNA为模板进行扩增，CT值会改变，溶解曲线也会异常。这样的反应对于引物和反应条件的要求太高，对于引物不是太了解的老师，还是老老实实地去DNA吧。小编用过几家公司的逆转录试剂，诺维赞和promega是明确有的，没有的公司就不列出了，可以私小编询）

配置qPCR体系                                   

PCR反应体系成分，H2O、 模板（CDNA）、引物、dNTP s、Taq DNA polymerase、Mg2+、ROX等吸光反应剂、反应buffer）（为了减少操作次数，降低误差，公司通常将红色字体部分合成一个或两个溶液MIX）

预配法（组内误差小）：将3个平行的孔样品计算3.5个体积先预先配好，再加到样孔里。目前很多老师都用的方法，但建议用下面方法。

交叉加样法（组间误差小）：分别配成引物体系和样品体系，再分别加到样孔里。

比如有A、B两个样品，pri1、pri2 、pri3三对引物

预配法是直接根据样品x引物=6，预配6个3.5体积的体系，然后加到副孔中。

交叉加样法，两个样品，每个样品分别要加到9个孔里，分别预配1份含有9.5体积的样品A和B的母液体系，将除了水之外的成分都加进去；3种引物，分别要加到6个孔里，分别预配1份含有6.5体积的引物体系，将水加到引物体系里；然后加到副孔中。

PCR程序                                        

95℃,30s; 95℃,10s; 60-65℃,10s, melt 为了增加特异性可以适当提高红色的退火温度。

结果处理                                        

目前常用的结果处理方法2-ΔΔCT

推导方法：PCR 扩增是指数扩增，假设扩增效率为100%，每一段原始模板扩增产物的量为 2 的 ct （cycle times ） 次方

由，PCR 产物量 = 2∧ct * 起始模板量

得，

起始模板量 = PCR 产物量／2∧ct = PCR 产物量 * 2∧ - ct

待检基因起始模板量 = PCR 产物量A * 2∧ - ct（待检基因）

内参基因起始模板量 = PCR 产物量B * 2∧ - ct（内参基因）

 PCR 产物量A=PCR 产物量B (插图说明)

由上面三个式子，可得

对照组中：待检基因起始模板量／内参基因起始模板量 = 2∧-【ct（待检基因）-ct（内参基因）】= 2∧-Δct

实验组中：待检基因起始模板量／内参基因起始模板量 = 2∧-【ct（待检基因）-ct（内参基因）】= 2∧-Δct

最终可以得出，实验组／对照组=2-ΔΔCT

计算实例：

常见问题                                       

​扩增曲线异常

正常qPCR的Ct值最好在15-30之间，扩增曲线呈较光滑完整的S型。平台期锯齿状、S型不完整、Ct值过大过小 等现象，都是扩增异常的现象。

红框，锯齿状平台期

1）扩增信号弱，增加模板量

2）RNA纯度低，建议制备高纯度RNA重新实验

3）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养

蓝箭头，曲线下滑

1）模板浓度太高

2）降低循环数

黑框，无S型曲线特征

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