一文搞定qPCR结果分析

Part 1 两张图搞定什么是qPCR

PCR是polymerase chain reaction，中文名称是聚合酶链式反应，是一种DNA体外扩增技术。它能使微量DNA大幅扩增，可以用于生物考古、亲子鉴定、犯罪调查等多个领域。

如下图所示，PCR利用DNA分子状态随温度变化的原理，通过DNA变性、复性（退火）、延伸三个过程实现DNA的扩增。首先，调整温度至高温（95℃左右）使DNA双链解离为单链；之后，降温至60°C左右，使引物与单链按碱基互补配对的原则结合；最后，调整温度至72°C左右（DNA聚合酶最适反应温度），使DNA聚合酶沿着5'-3'的方向合成互补链。PCR仪实际就是一个温控设备，通过控制温度在变性温度，复性温度，延伸温度之间的循环变化，实现DNA的扩增。

图1

qPCR是Real-time Quantitative PCR的简称，中文名称是荧光实时定量PCR。它的目的是定量DNA。方法是在DNA扩增系统中加入荧光标记物质（如图2），使得扩增的DNA可以发出荧光信号，通过检测荧光信号的强度，结合DNA的扩增循环数，计算扩增前DNA的量。

图2

Part 2 一个公式搞定qPCR定量的数学原理

如前文所述，qPCR的目的是明确扩增前的DNA分子数。假设扩增前DNA分子数为N0，扩增后的DNA分子数为N，扩增循环数为n，结合图1可知，DNA扩增时产物分子数以2为底数呈指数增长，因而N与N0之间存在以下关系：N=N0×2^n。其中N、n均为可知变量（N可以通过测定的荧光信号的强度得到，n可以在机器上设定），于是N0可求。

但受扩增体系中酶、引物、程序等因素的影响，实际扩增反应中，N与N0之间的关系稍复杂了一点：N=N0×(1+e)^n，其中的e是扩增效率。红色公式是qPCR相对定量和绝对定量这两种数据分析过程的核心，所有计算公式都是通过这一公式或是其变式得来的。希望大家牢记在心。

Part 3

qPCR数据分析时，需要重点关注三个图谱：扩增曲线、融解曲线、标准曲线。前者有计算N0所需要的Cq/Ct值，后两者与NTC、NRT都是确保Cq/Ct值可用的数据。

先说扩增曲线。

扩增曲线有两种形式：线性图谱和对数图谱（如图3、图4），二者的横坐标都是DNA扩增循环数，不同的是前者的纵坐标是荧光信号变化量（实时荧光强度减去基线荧光强度），后者则是荧光信号变化量的对数。

图3 线性图谱

图4 对数图谱

两种扩增曲线均分为四部分：基线期、 指数增长期、线性增长期和平台期。

在基线期，扩增产物很少，所产生的荧光信号很低，反应了系统背景情况；

在指数增长期，PCR产物呈指数增加；

在线性增长期，PCR产物呈几何倍数增加；

在平台期，由于原料消耗殆尽，扩增减缓，荧光信号不再随循环数增加而增加。

只有指数增长期是我们需要关注的部分，因为只有在这一时期，N与N0之间的关系才满足N=N0×(1+e)^n，我们才可以借助这一公式计算N0。

扩增曲线中需要关注的有三个概念：基线、阈值、Cq（或称Ct）值。

基线：通过扩增曲线的水平部分的直线，仪器通常设置为第3-15个循环。

阈值：是一个荧光强度值，穿过阈值与X轴平行的直线称为阈值线，仪器通常设置为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

基线与阈值线都可以手动调整，调整时需要注意，同一个基因必须使用同一基线和阈值线，另外，阈值必须落在指数扩增期。

Cq/Ct值，是阈值线与扩增曲线的交点对应的横坐标，其实就是N=N0×(1+e)^n这一公式中的n，也就是DNA扩增的循环数。Cq/Ct的合理范围为15-35。太大或者太小都会导致定量结果的不准确。

拿到了Cq/Ct值，是否可以直接用来数据分析呢？

实际并不是，在那之前，还需要看看融解曲线和标准曲线以及NTC、NRT、Cq/Ct值的范围。

关于融解曲线的形成原理，可移步至 https://zhuanlan.zhihu.com/p/338424844

关于融解曲线异常图形的解读及处理对策，可移步至 https://www.sangon.com/class_qPCR_curve.html

NTC和NRT分别指的是无模板对照（体系中的cDNA用水替代）和no-reverse transcription controls（体系中的cDNA用未进行反转录的RNA替代），分别用于排除基因组DNA的污染和非预期的扩增产物（例如，引物二聚体）。

Cq/Ct的合理范围为15-35。太大或者太小都会导致定量结果的不准确。

最后，鉴于相对定量的推导（图5）的前提是内参基因和目的基因有相近的扩增效率，因此，在使用△△Cq法计算之前，首先要确定二者的扩增效率是否相近。扩增效率的计算可移步至 https://www.sohu.com/a/www.sohu.com/a/465240324_216835

相对定量的推导原理如图5所示——尤其需要注意的是，这一公式成立的前提是内参基因和目的基因有相近的扩增效率，因此，在使用△△Cq法计算之前，首先要确定二者的扩增效率是否相近。

图5

经过上述步骤的排检，就可以用Cq/Ct进行相对定量计算了。相对定量的计算采用的是△△Cq法，具体的操作在B站上有很多资源，可以参考学习（如 https://www.bilibili.com/video/BV1NA411T7Ew?spm_id_from=333.337.search-card.all.click ）。

Part 3

一张表搞定qPCR投稿时需要的所有资料

完成了qPCR的数据分析，投稿的是否是否就万事大吉了呢？只要搞定下面这张checklist就可以！

2009年，英国Stephen A．Bustin等提出MIQE指南(The Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)，明确了投稿时荧光定量PCR应提供的相关资料。

有前辈对应每一条目进行了详细讲解，大家可移步至以下网址学习操作：

https://www.sci666.com.cn/64815.html

https://www.sci666.com.cn/64913.html

其他相关资料

https://www.vazyme.com/news/370.html

https://www.bilibili.com/video/BV1yL4y1V7Uz?spm_id_from=333.337.search-card.all.click

https://www.bilibili.com/video/BV1J54y1G7Vp?spm_id_from=333.337.search-card.all.click

如此帖有表述不清之处，还请在评论区提出，力求修改至一眼即懂，帮助大家一文搞定qpcr数据分析！