【原创】做荧光定量PCR有一些陷阱，你要很小心

我们在做荧光定量PCR的时候，常常会遇到一些问题，这些问题如果不加以注意，很可能会影响到我们的研究进展。今天想结合我自己做荧光定量PCR的真实经历，讲一讲这些问题，希望能对大家有所帮助。

问题一：关于Ct值

记得，做第一个小课题实验的时候，我有一个基因的Ct值是大于35的。当时没有特别注意，因为从扩增曲线上来看，“似乎”是扩增成功了。直到有人告诉我说，你这个Ct值是不能用的，Ct大于35就相当于没有扩出来。后来，自己查了一下实验相关的基本知识，才知道，原来Ct值是有一个合理范围的：通常情况下，认为Ct值在15到35这个范围是比较合理的，超过35就算它没有扩增，小于15就是模板浓度太高，需要加以稀释。

问题二：关于引物特异性

我自己的引物是在NCBI上面设计的，此前我在园子里面介绍过这个方法（具体请参见： https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/43622090 ）。当时设计过后，我还专门使用NCBI里面的Primer BLAST对引物的特异性进行了检测，并没有非特异性结合产物。按理来说，这些引物的特异性应该足够强了吧？可是，事实是，有几个基因就是扩不出来，Ct值总是大于35。后来，我打电话咨询了公司的技术老师。那位老师告诉我说，没有非特异性扩增并不代表这个引物实际的结合效率就很强，引物实际的结合效率需要通过实验去进行检测。老师进一步告诉我说，他们在公司里面一般会针对一个基因做多对引物，然后一对一对进行尝试，以此筛选出结合效率最强的那一对引物。由此可见，实际的结合效率是不可能通过软件检测出来的，只能通过实验。在老师的指导之下，我重新设计了引物，准确地说，是更换了引物，后来做出了符合需要的Ct值。

问题三：关于那些低表达基因

我们做荧光定量PCR的时候，可能会发现一些基因用了各种方法但就是扩增不出来。这时，要警惕那些本身就是低表达的基因。那么，如何确定这个基因是不是低表达的基因呢?给大家推荐一个数据库（ https://www.proteinatlas.org/ ），这是瑞典卡罗林斯卡医学院那边做的，这个网站对一些常见基因在组织和细胞内的表达情况有系统的介绍。

低表达的基因为什么这么难扩增成功呢？大家想一下，我们做反转录这一步的时候，通常使用的引物都是试剂盒里面提供的通用引物，经过反转录后，可以得到各种各样基因的cDNA。对于一个低表达的基因来说，在反转录这一步是非常“吃亏”的，因为我们的通用引物不会因为你的量少，就特殊照顾你，最后的结果就是，我们做荧光定量PCR的时候会因为低表达基因的cDNA量太少而扩增失败。

那么，该怎么办呢？这里给大家介绍一个方法，就是使用这个低表达基因的特异性引物去做反转录。前面说到通用引物不会特殊照顾低表达基因，特异性引物则可以解决这个问题。当然，既然目的基因使用了特异性引物，内参基因也必须要使用特异性引物了。具体怎么操作呢？举个例子，如果我们先前做反转录使用的是1个单位的通用引物，那么现在就可以将低表达基因和内参基因各加0.5个单位（这里，还有一个问题需要明确一下，我们所加的0.5单位低表达基因的特异性引物应该是它的反向引物！反向引物！反向引物！重要的事情说三遍！）。其余的操作步骤不变。

@丁香通讯员