【分享】超实用的引物设计操作，一看就学会

NCBI引物设计与检测方法

1. 如何查找序列？

例：需查找小鼠基因GAPDH。

1) 打开NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）；

2) 选择Gene库，搜索框输入基因名（GAPDG）和物种（[mus]），点击Search进行查找；

3) 选择目标基因（注意基因名称和物种）；

4) 下拉至Genebank处，点击进入

5) 以下即为目的基因的基本信息；

（1）若目标序列为基因组DNA，则直接下拉至最底部，即为该基因的基因组DNA序列；可直接复制保存，也可输出Fasta格式文件（右上角send to—File—Format（FASTA）—Creat File）（红框标记处）。

（2）若目标序列为CDS序列：

A. 则在基因基本信息页面左侧找到mRNA及ID，点击转录 ID进入该基因mRNA界面，下拉至最底部为mRNA序列；

B. 页面左侧找到CDS并点击后，可发现mRNA序列有部分变为褐色，褐色部分即为CDS序列，可进行复制并保持序列。

2. 使用NCBI Primer BLAST设计qPCR引物

1)  打开NCBI网站，拉至最下方，找到Primer-BLAST；

2) 点击进入Primer-BLAST界面；

) 3左上方输入基因号或Fasta格式的序列。A. 目标产物长度一般在100-200bp，也可以放宽至100-300；B. Tm通常处于57-63℃，60℃最佳；C. 为减少qPCR实验中基因组污染，最好进行跨外显子设计引物，即选择”Primer must span an exon-exon junction”；

4) 选择物种后，点击Get Primers，耐心等待引物设计结果；

5) 引物设计结果：包含引物序列、长度、Tm、GC含量、自配率、扩增长度等。

3. 引物特异性检测（NCBI Primer BLAST）

1) 打开NCBI网站，拉至最下方，找到Primer-BLAST，点击进入；

2) 输入上下游序列，选择Database和物种，点击get Primers；

3) 结果分析，包括引物基本信息（Tm、GC含量、自我配对）、产物长度以及在该物种中是否有非特异扩增。

引物设计一般原则：

1)长度：15-30 bp，常用为18-27 bp，但不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(72度)，从而降低产物的特异性。

2)引物GC含量一般应在40-60%，Tm值一般在55-70℃之间比较合适，上下游GC含量合Tm值应保持接近，两个引物Tm值不应超过4℃。

3)碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在3’端出现超过3个连续的G或C，否则会使引物在GC富集区错误引发。

4)引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。

5)引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。

6)上下游引物的互补性：一个引物的3’末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。