NCBI使用教程2：手把手教你QPCR引物设计

在生物学研究中，我们经常使用的实验检测方案就是QPCR，那我们就离不开最为关键的引物设计。小编为大家整理如何使用NCBI来进行引物设计。

Primer-Blast介绍

Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应( PCR)的特异性寡核苷酸引物。Primer-BLAST可以直接从Blast主页(

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) 找到，或是直接用下面的链接进入：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。

Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用

Blast进行引物特异性验证。并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基

因的引物- an important feature for PCR protocols measuring tissue specific expression。Primer-BLAST 有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBIBLAST更加准确。

1.查找序列并打开Primer-BLAST

（以人类GSR基因为例）

有两种方式，一种是按上期方法找到目的基因mRNA的页面，然后点击页面右侧工具栏内的Pick Primers

另一种方法是复制好目的序列后，在NCBI主页点击Blast，然后选择Primer-BLAST，把序列输入框内即可。

2.在Primer-BLAST中输入相关参数

上图intron inclusion后的勾勾，但如果勾选上得不到结果，就可以不选。以上两步都是为了防止DNA污染。

最后点击Get primers，获得引物序列。

3.获得引物

选择完成后大概需要运行几十秒，得到若干对引物后进行选择，尽量挑选引物GC百分比在45%-55%之间，Tm在60摄氏度左右的引物序列。

引物的选择要综合各个条件来考虑引物的自身主观的质量和客观特异性。当然根据不同的实验，对设计出来的引物也会有不同的要求。但最终确认这对引物是否能够达到实验目的还是要以最终的实验结果为准。

好，本期QPCR引物设计的内容就介绍到这里。

下期文章：NCBI使用教程3-基因序列的比对，喜欢的记得点个关注哦~

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